核酸核酸检测技术43讲解.pptx

核酸核酸检测技术Nucleicaciddetectiontechnology荧光定量PCR

定义：是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过Ct值和标准曲线对未知模板起始浓度进行定量分析的方法。荧光定量PCR，又称实时PCR(real-timePCR)

定量PCR与常规PCR的差别对PCR扩增反应的终产物进行定量及定性分析。常规PCR技术定量PCR技术通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。

DNA交联荧光染料技术结合的荧光信号和DNA含量成正比

与DNA双链结合时发光游离时不发光

热变性引物退火延伸反应

荧光共振能量转移技术水解探针-Taqman双荧光标记探针分子信标molecularBeacon荧光标记探针荧光标记杂交双探针

水解探针TaqMan荧光素淬灭剂与目标序列互补TAMRADABCYLFAMTETJOEHEXVIC

5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针Taqman探针法——原理

探针与目标序列配对时，发生荧光共振能量转移(FRET)光能量转移Taq游离的探针荧光基团淬灭剂延伸时，Taq酶水解探针，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离而发出荧光，形成荧光信号Taq发出荧光光另一波长的荧光

1.退火，开始聚合2.遇到探针3.Taq酶的5′→3′外切活性4.聚合完成R=报告基团ReporterQ=淬灭基团QuencherTaqMan作用机理

每产生一条DNA链，就切断一条探针每切断一条探针，就产生一个单位信号信号强度与结合探针的DNA分子数成正比3’上游引物RTaqMan探针Q5’5’3’5’RQ下游引物3’5’3’

由于PCR扩增效率的差异使得相同的样品扩增结果存在很大的差异同时扩增96的相同样品的结果起点定量与终点定量起始DNA量是天然的量，更有意义；终点DNA量是经过PCR加工的量，存在部分失真起点定量重现性好，终点定量误差大

实现对起始模板定量和定性分析

扩增曲线——四个阶段线性图谱对数图谱

扩增曲线分析线性基线期指数增长期3个时期平台期基线（Baseline）阈值线（Threshold）3个基本概念Ct值（Cyclethreshold）

荧光定量PCR原理－－基线线性图谱对数图谱

前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline）荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段真正的信号：荧光信号超过阈值荧光定量PCR原理－－荧光阈值Cycle（循环数）Rn（荧光强度）BaselineLg－linerphaseThreshold平台期

PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。Ct值的定义：Cycle（循环数）Rn（荧光强度）Ctvalue荧光定量PCR原理－－Ct值

CyclenumberCk104Ck102SampleLgofDNAconcentration荧光定量PCR原理－－Ct值与模板起始量的关系模板DNA量越多，荧光达到阈值的循环数越少，即Ct值越小。

减少生物学误差：管家基因减少其他误差：重复样本

绝对定量－－标准曲线

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