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人CD1d分子胞外区的原核表达及其多克隆抗体的制备--第1页
人CD1d分子胞外区的原核表达及其多克隆
抗体的制备
作者：陈章权*,黄震,梁晓东,陆田田,何天文
【摘要】目的:原核细胞表达人CD1d分子胞外区及制备其
多克隆抗体。方法:用RT-PCR法扩增人CD1d分子胞外区基因,将其
克隆入原核表达载体pET28中,转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG
诱导重组蛋白的表达,用亲和层析法纯化重组蛋白,以之为免疫原免
疫小鼠制备多克隆抗体,并以ELISA、Westernblot及免疫组织化学
法检测抗体。结果:在原核细胞中高效表达和纯化了人CD1d分子胞外
区蛋白,用其免疫小鼠,获得了效价高、特异性较好的多克隆抗体,
免疫组织化学检测显示该抗体可识别人小肠组织中的天然CD1d分子。
结论:成功制备了人CD1d分子胞外区重组蛋白及鼠抗人CD1d分子胞
外区抗体,为进一步建立人CD1d分子的免疫学检测方法及其生物学
功能的深入研究奠定了基础。
【关键词】CD1d基因表达抗体制备
CD1分子是独立于MHC分子之外的第三类抗原提呈分子,分
为CD1-I和CD1-II两组,前者包括CD1a、CD1b、CD1c和CD1e等4
个分子,后者只有CD1d分子［1］。CD1d分子由胞内区、跨膜区和胞
外区组成,胞外区又由α1、α2和α3等3个结构域组成,它主要提
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呈糖脂抗原,在免疫调节及与感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤
等疾病的发生发展过程中起重要作用［1,2］。在CD1d基因克隆过程
中,我们发现在某些疾病患者体内存在
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α3结构域或跨膜区缺失的变异体,跨膜区缺失的变异体的存在
提示患者体内可能存在可溶性CD1d分子。为此,我们拟建立双抗体夹
心ELISA法进行可溶性CD1d分子的检测,但目前尚未见有其商品化
ELISA检测试剂盒。特异性抗体的获取是建立ELISA检测方法的关键
所在,在成功制备兔抗人CD1d分子α3结构域抗体［3］的基础上,我
们又对人CD1d分子胞外区编码基因进行了重组表达,并制备了其鼠
源性抗体。
1材料和方法
1.1材料大肠杆菌DH5α、大肠杆菌DL21-DE3为本室保存。
克隆载体pGEM-T、反转录试剂盒购自Promega公司;表达载体pET28
和Ni2+-NTA凝胶为Invitrogen公司产品。RNA提取试剂、PCR产物
回收、质粒纯化试剂盒为QiaGen公司产品。Taq酶购自大连宝生物
工程公司。IPTG及DAB购自上海生物工程有限公司。HRP标记的羊抗
鼠IgG为Chemicon公司产品。PVDF膜为美国PALL公司产品,常规试
剂为国产分析纯。引物合成及DNA序列测定委托上海生物工程公司完
成。BALB/c小鼠由广东医学院实验动物中心提供。
1.2方法
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1.2.1CD1d分子胞外区编码基因的克隆取手术切除的新鲜
人
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