有哪些信誉好的足球投注网站- 1、本文档共12页，可阅读全部内容。
- 2、有哪些信誉好的足球投注网站（book118）网站文档一经付费（服务费），不意味着购买了该文档的版权，仅供个人/单位学习、研究之用，不得用于商业用途，未经授权，严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等，侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传，本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺！文档内容仅供研究参考，付费前请自行鉴别。如您付费，意味着您自己接受本站规则且自行承担风险，本站不退款、不进行额外附加服务；查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档，您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等，请点击“版权申诉”（推荐），也可以打举报电话：400-050-0827(电话支持时间：9:00-18:30)。
- 5、该文档为VIP文档，如果想要下载，成为VIP会员后，下载免费。
- 6、成为VIP后，下载本文档将扣除1次下载权益。下载后，不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们。
- 7、成为VIP后，您将拥有八大权益，权益包括：VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
- 8、VIP文档为合作方或网友上传，每下载1次， 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等，对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
3
有机肥中大肠杆菌活菌PMA-qPCR快速测定
1范围
本标准规定了有机肥料中大肠杆菌活菌采用PMA-qPCR快速测定方法的技术要求。本标准适用于有机肥料中大肠杆菌活菌的检测。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求
NY525-2012有机肥料
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1PMA（叠氮溴化丙锭）PropidiumMonoazide
一种具有高亲和力的光敏反应DNA结合染料。染料自身的荧光非常微弱，但是结合核酸后荧光信号很强。
3.2实时定量PCR（qPCR）QuantitativeReal-timePCR
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。
3.3Ct值cyclethreshold
每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。
4原理
叠氮溴化丙锭（PMA）能够透过死菌细胞膜，在强光照射下可与其DNA发生不可逆转的结合，使死菌DNA不能作为模板进行PCR扩增，而活菌能进行PCR扩增。
5引物
目的基因：uidA
上游引物序列UAL1939b：5’-ATGGAATTTCGCCGATTTTGC-3’下游引物序列UAL2015b：5’-ATTGTTTGCCTCCCTGCTGC-3’
4
6试剂
6.1PMA试剂
6.1.1PMA储备液
将1mgPMA染料溶解于200μL20%的DMSO（dimethylsulfoxide，二甲基亚砜）溶液中，充分溶解并混匀，制成5μg/μL的储存液，于-20°C避光保存。
6.1.2PMA工作液
将PMA储备液以20%DMSO溶液稀释10倍。
6.2DNA提取试剂盒
主要包括：裂解液、清洗液、洗脱液、磁珠。于室温保存（16～30℃),置于阴凉干燥处。使用之前检查产品有效期，请勿使用过期试剂。
6.3SYBR?PremixExTaqTM(TliRNaseHPlus)
SYBR?PremixExTaqTM(TliRNaseHPlus)内含：TaKaRaExTaqHS，dNTPMixture，Mg2+，TliRNaseH，SYBR?GreenI。
配套RoxReferenceDye或RoxReferenceDyeII，用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。
6.4qPCR标准品制备
采用LB或BHI培养大肠杆菌标准菌株，取1mL菌悬液以8000r/min的转速离心10min以收集菌体，提取其全基因组DNA。采用微量分光光度计测得DNA浓度，按（1）式换算成基因的拷贝数：
基因拷贝数=全基×660×NA…………（1）
式中：
DNA浓度——copies/μL
全基因组大小——大肠杆菌全基因组大小NA——阿伏伽德罗常数6.02×1023
目标基因经PCR扩增后将特异性引物连接进载体，经过酶切鉴定、测序分析、质粒的提取等步骤获得大肠杆菌DNA标准品。使用时将DNA以10倍梯度稀释得到大肠杆菌qPCR系列标准品。
6.5磷酸缓冲盐溶液（PBS）
6.5.1A液（0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液）：NaH2PO4·H2O27.6g，先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释至1000mL。
6.5.2B液（0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液）：Na2HPO4·7H2O53.6g（或Na2HPO4·12H2O71.6g或Na2HPO4·2H2O35.6g），先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释至1000mL。
5
6.5.30.01mol/LPBS的配制：A液14mL，B液36mL，加氯化钠8.5g，最后用蒸馏水稀释至1000mL，于121℃,15min高压灭菌，4℃保存备用。
6.695%乙醇
7主要仪器设备
PMA-LiteTMLEDPhotolysisDevice(E90002)光解仪、恒温震荡培养箱、恒温金属浴、低温离心机、微型孔板离心机、漩涡震荡器、核酸提取仪、qPCR仪、超微量分光光度计等。
8
文档评论（0）