已知基因序列的获取策略.ppt

5’端序列的修饰与标记：可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等.通常应在5‘端限制酶位点外再加1-3个保护碱基。01简并引物：应选用简并程度低的密码子,例如选用只有一种密码子的Met,3’端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。02同源性或互补性：两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。03GC含量：一般为40-60%。另外，上下游引物的GC含量不能相差太大。04Tm值：引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。有多种计算方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在软件中常使用的是最邻近法(thenearestneighbormethod)。G值：指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端△G值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间△G值相对较高的引物。引物的3’端的△G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。01引物设计02限制性内切酶位点分析03DNA基元(motif)查找04同源性分析PrimerPremier5.0GenetoolV2.0Oligo6.69常用本地软件：Clonemanager、VectorNTI、DNAstar和ds-Gene等010102在线工具：BLAST等02四、测序图比对、拼接与虚拟克隆(insilicocloning)DNAstar的SeqMan模块01VectorNTI程序的ContigExpress模块02Sequencher03常用序列拼接软件已知基因序列的获取策略

——兼谈引物设计与序列分析黄钢第三军医大学遗传教研室2006.11.1.0102030405选取相应的组织或细胞，提取RNA并RT01PCR扩增获得全长cDNA02根据需要进一步进行亚克隆04装入合适的克隆或表达载体，菌落PCR、酶切与测序证实03RNaseH消化（可选）05获取序列信息，设计合适的引物先查找其蛋白相关信息,了解该基因编码产物的基本情况与功能（）01进一步查找其核酸相关序列信息，常用数据库：Genebank、EBI、DDBJ02一、如何获取已知目的基因的序列信息cDNA文库扫描01RT-PCR02人工合成03二、目的基因cDNA序列的获取方法12543在匀浆器中加工冷冻的组织通过注射器加工冷冻的组织在液氮中将组织研磨成粉末在液氮中研磨组织至粉末状，细胞裂解更完全，产量比前二者多一倍。合适的RNA提取方法加上合适的组织处理方法，才能够获得最佳的提取效果12345组织RNA的提取RNA提取两要素忌讳贪多：不能指望1mlTrizol提取100mg以上组织，一般50mg用1mlTrizol较合适速战速决：尽量缩短提取时间，不要完全照搬Protocol,比如匀浆后如果没有很多组织碎片的话，可以立即加入氯仿，立即离心，14000rpm离心10min,取完上清加入0.6~1体积的异丙醇，立即高速离心（14,000rpm,5min），.....总之尽量快速！RNase的危害主要集中在将RNApellet溶解在水中之后，防止RNA降解的重点应当放在组织样本的保存和RNA水溶液的保存上。01注意实验前的准备工作：各种器材的去RNAase处理与无RNAase的准备。02长期保存RNA时建议用去离子甲酰胺溶解总RNA沉淀03尽量减少RNAase污染荧光染色、毛细管电泳和Agilent2100生物分析仪分析检测RNA溶液的吸光度保温试验RNA的电泳图谱如何确认RNA的质量CBA28S18S5SSTEP3STEP2STEP1GSP：适合序列肯定的模板，常用于一步法RT－PCR。但是引物设计质量影响RT的结果。在扩增低丰度的转录本时是最好的。OligodT引物:真核生物的mRNA适用，建议用于高质量RNA及全长转录本的逆转录；随机引物：适合各种RNA的RT，可用于mRNA片段的逆转录。RT引物的选用RT中提高合成全长cDNA的效率消除mRNA二级结构：逆转录之前将RT引物与RNA模板进行短暂的热变性,可破坏mRNA二级结构,促进锚定引物与模板的正确配对。选用RNaseH灭活改造的新型耐高温逆转录酶：Thermoscript、Superscr