TGXAS-虾肝肠胞虫检测 荧光定量PCR法.docx

Q/LB.□XXXXX-XXXX

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ICS

FORMTEXT65.020

CCS

FORMTEXTGXAS

FORMTEXTB52

团体标准

T/FORMTEXTGXASFORMTEXTXXXX—FORMTEXTXXXX

FORMTEXT

FORMTEXT虾肝肠胞虫检测荧光定量PCR法

FORMTEXTDetectionforEnterocytozoonhepatopenaeibyrealtimePCRmethod

FORMDROPDOWN

FORMTEXT（本草案完成时间：2021.4）

FORMDROPDOWN

FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX发布

FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX实施

FORMTEXT广西标准化协会??发布

STYLEREF标准文件_文件编号T/GXASXXXX—XXXX

STYLEREF标准文件_文件编号T/GXASXXXX—XXXX

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前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由广西壮族自治区水产科学研究院提出并宣贯。

本文件起草单位：广西壮族自治区水产技术推广站、广西壮族自治区水产科学研究院。

本文件主要起草人：童桂香、江林源、韦信贤、林勇、谭红连、胡大胜、介百飞、李旻、李秀珍。

STYLEREF标准文件_文件编号T/GXASXXXX—XXXX

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虾肝肠胞虫检测荧光定量PCR法

范围

本文件描述了虾肝肠胞虫荧光定量PCR检测法的试剂与材料、仪器设备、操作方法及结果判定。

本文件适用于虾肝肠胞虫的检测。

规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法

SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范

试剂与材料

一般要求

本标准所用试剂如无特殊说明均为分析纯试剂；试验用水应符合GB/T6682一级水的要求。

引物与TaqMan-MGB探针

上游引物EHP-qF、下游引物EHP-qR、TaqMan-MGB探针EHP-qP根据表1给出的寡核苷酸序列人工合成，扩增66bp的目的片段。使用浓度均为10μmol/L。使用前按本标准要求先用灭菌DEPC水稀释，稀释后分装成小量置于-20℃保存备用，避免反复冻融。

特异性引物及探针寡核苷酸序列及扩增的目的片段大小

引物/探针

序列（5′--3′）

扩增产物（bp）

EHP-qF

CGCGGTAATTCCAACTCCAA

66

EHP-qR

TCTACGACTACGGACCCTTTAACTG

EHP-qP

FAM-AGTGTCTATGGTGGATGCT-MGB

DNA抽提试剂

商品化DNA抽提试剂盒。

异丙醇。

无水乙醇。

荧光定量PCR试剂

2×PremixExTaq?(ProbeqPCR)。

ROXReferenceDyeⅡ或ROXReferenceDye：参考仪器使用说明，用以校正孔间荧光信号误差。

工作标准品为pMD18-T-SSUEHP：可委托生物公司制备，使用浓度为1.0×104拷贝/μL～1.0×107拷贝/μL。

阳性对照为已知EHP阳性的对虾组织，-80℃保存。

阴性对照为已知EHP阴性的对虾组织，-80℃保存。

空白对照以无菌双蒸水为模板。

仪器设备及耗材

仪器设备

定量PCR仪。

高压灭菌锅。

组织匀浆机。

普通冰箱：具冷藏箱，可达到-18℃以下冷冻箱体。

超低温冷藏设备：可达到–80℃。

水浴锅或金属浴。

台式高速离心机：最高转速可达12000r/min以上。

旋涡振荡器。

微量离心机。

微量移液器。

耗材

微量移液器枪头。

1.5mL微量离心管：经高压蒸汽灭菌，一次性使用。

灭菌0.2mLPCR管：经高压蒸汽灭菌，一次性使用。

塑料或乳胶手套：一次性使用。

操作方法

采样

样品采集按SC/T7103的规定执行。

样品前处理

虾样按不同规格取不同组织。其中，受精卵、幼体、仔虾采集整条虾作为样品，3cm以下幼虾采集除虾眼外整