外源基因表达与基因工程药物.ppt

载体与目的片段连接影响限制性内切酶活性的因素DNA的纯度DNA甲基化程度底物DNA的分子构型反应温度反应系统组成酶量、反应体积、酶切时间限制酶的用途DNA重组与构建新基因组文库组建DNA物理图谱DNA分子杂交制备DNA放射性探针DNA序列分析大肠杆菌DNA连接酶：只能连接具粘性末端DNA分子，以NAD作辅助因子T4DNA连接酶：连接粘性末端，高浓度可连接平末端，要求3′-OH和5′-PO4。催化过程需要ATP和Mg封闭DNA链上缺口酶，借助能量催化DNA链的5′-PO4与另一DNA链的3′-OH生成磷酸二酯键。用于DNA重组和质粒的构建DNA连接酶聚合酶以DNA(RNA)为模板，催化DNA(RNA)的体外合成特点：以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为前体催化合成DNA需要模板和引物的存在不能起始合成新的DNA链催化dNTP加到生长中的DNA链的3-OH末端催化DNA合成的方向是5→3大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ：5′→3′的聚合作用′→5′的外切酶活性5′→3′外切酶活性Klenow聚合酶：5′→3′聚合酶活性′→5′外切酶活性没有5′→3′外切酶活性用于填补DNA单链末端成为双链聚合酶的分类及特点聚合酶的分类及特点T4-DNA聚合酶：无5′→3′外切酶活性、需要一条有引物的单链DNA作模板、3′→5′外切酶活性TaqDNA聚合酶：5′→3′聚合酶活性5′→3′外切酶活性，有链置换合成能力不具有3′→5′外切酶活性，没有校正功能良好的热稳定性用于DNA序列分析和PCR反应逆转录酶（reversetranscriptase）两类：禽类成骨细胞性白血病病毒逆转录酶(AMV)moloney小鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV)作用：以RNA为模板合成DNA,构建cDNA文库RT-PCR制备杂交探针以RNA为模板合成DNA的酶(RNA指导的DNA聚合酶)去除DNA/RNA5′-P，制备载体时可防止载体自身连接，提高重组效率碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）：在DNA的3＇-OH上，加上dNTP末端脱氧核苷酰转移酶：DNA和RNA的修饰酶载体DNA与目的基因的连接粘性末端连接平末端连接同聚物接尾连接接头连接法用于基因转移的受体菌或细胞受体细胞应具备的条件各种基因工程受体的特性实验室常用的基因工程受体宿主系统防止重组细菌扩散污染，生物武器除具有与载体选择标记互补的表型用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-）外切酶和内切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-）感染寄生缺陷型具有较高的转化效率重组整合缺陷型限制性缺陷型受体细胞应具备的条件01.有较好的翻译后加工机制02.蛋白水解酶基因缺陷或表达水平低，以减少外源蛋白的降解实现高效表达对于表达用宿主细胞还应该有：大肠杆菌遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子产结构复杂、种类繁多的内毒素适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌02010304各种基因工程受体的特性枯草杆菌01遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全，生长迅速，培养简单，不产内毒素02遗传欠稳定，载体受体系统欠完备03适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌04各种基因工程受体的特性抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产内毒素主要用于抗生素生产菌株的改良遗传不稳定，生长相对缓慢链霉菌02030401各种基因工程受体的特性酵母菌内源性蛋白产物种类繁多且含量高具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定适用于外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌各种基因工程受体的特性昆虫细胞（家蚕）DNA重组操作系统欠完善具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定适用于真核生物基因的高效表达各种基因工程受体的特性哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞CHO）细胞培养条件苛刻，生长缓慢与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适的糖基化修饰系统适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，是DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体各种基因工程受体的特性植物细胞（拟南芥菜、烟叶）农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞培养简单且成本低廉，具有