检验技术化学发光和荧光免疫技术及仪器.ppt

一、基本原理第38页,共47页，星期六，2024年，5月技术特点1．ECLIA为非核素方法，可避免核素的放射性污染2．为均相免疫测定技术，检测中不需要分离结合相和游离相，操作简便3．磁性微珠包被技术的应用使检测的灵敏度更高、线性范围更宽、反应时间更短。4．标记物Ru稳定性好，室温下半衰期大于1年，所标记的蛋白活性在2～4℃也可保持1年：以上。5．标记物可进行化学修饰，以形成易于和蛋自、半抗原及核酸等分子结合的活性NHS酯或磷酰胺基团，可用于各种分析物的检测。6．标记物相对分子质量小，在一个抗体分子上可同时标记许多标记物分子而不影响抗体的免疫学活性，也可用于核酸的标记而不影响探针的杂交活性。7．标记物的再循环利用使发光反应的时间更长、发光强度更高，更易于测定。8．仪器的没计使操作较为简便，更易于实现自动化。第39页,共47页，星期六，2024年，5月二、标记物钌的衍生物，分子结构简单、稳定、相对分子质量小、水溶性强、空间位阻小等特点，可与待测物质进行全量反应．使得ECLIA的测定具有高效性与稳定性且没有噪声干扰。三联吡啶钌第40页,共47页，星期六，2024年，5月第三节时间分辨荧光免疫分析法一、基本原理抗原抗体反应荧光物质标记时间分辨技术++原理：第41页,共47页，星期六，2024年，5月用三价稀土离子及其螯合剂作为示踪物(代替荧光物质、放射核素或酶)，通过双功能基团的螯合剂与蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞以共轭双键结合进行标记，待反应体系(如抗原抗体免疫反应、生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀伤反应等)发生后，三价稀土离子螫合物可以在紫外光激发下，发出强度高(波长为613nm左右)、持续时间长(10～l000μs)的荧光，利用延缓测量时间，待样品中蛋白质等背景荧光完全淬灭后，再测量三价稀土离子螯合物的特异荧光，根据荧光强度和相对荧光强度的比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的第42页,共47页，星期六，2024年，5月时间分辨技术消除背景荧光:在检测样品中，含有各种蛋白质和其他化合物，这些物质在较大波长范围内都可产生自发荧光,寿命短.镧系离子荧光寿命很长（10us～1.0ms），比背景荧光长3～4个数量级。所以应用荧光的时间分辨技术在背景荧光已经降到很低时再开始检测稀土鳌合物的荧光，从而消除了非特异性荧光的干扰。解离-增强原理:较大的Stocks位移（即激发光波长与发射光波长之差）和较窄的发射峰等都增大了检测的信噪比;特点：第43页,共47页，星期六，2024年，5月二、标记物和螯合剂1．TRFIA标记物——三价镧系稀土元素常用的为铕(Eu3+)，钐(Sm3+)、铽Tb3+)等(1)激发光谱带较宽(2)发射光谱带很窄(3)荧光寿命长(4)Stokes位移较大(250～350nm)(5)稀土元素标记物比较稳定2．螯合剂具有双功能基团的螯合剂，其一侧基团与Eu3+连接，另一侧与抗体或抗原上的自由氨基连接。香羧酸类螯合剂多氨基多羧基类螯合剂β-二酮体类螫合剂聚氨基多羧酸酐与氨基芳香羧酸缩合物第44页,共47页，星期六，2024年，5月三、方法分类1．按反应类型分为固相竞争法和非竞争法(双抗体夹心法)。2．按是否加入增强液分为两大系统，需要加入增强液的，以瑞典LKB公司的ArcusTRFIA体系为代表；不需要加入增强液的，以加拿大CyberFluorTRFIA体系为代表。第45页,共47页，星期六，2024年，5月第四节荧光偏振免疫分析法FPIA是根据抗原、抗体竞争结合反应的原理，通过测定荧光偏振度定量检测待测抗原的浓度。FPIA兼具荧光分析的灵敏度和均相免疫法专一、快速的特点，故测定结果重现性好，在免疫测定法中引人注目。在临床检验、毒品分析、农药残留量分析、环境和食品监测等方面第46页,共47页，星期六，2024年，5月第五节化学发光免疫分析的临床应用(一)甲状腺疾病相关免疫检测(二)生殖内分泌激素检测(三)贫血的检测(四)肿瘤标志物的检测(五)心肌蛋白的检测(六)传染病相关项目的检测(七)骨代谢相关标志物(八)自身抗体的检测(九)药物浓度的监测(十)核酸分析第47页,共47页，星期六，2024年，5月(一)产生化学发光反应的条件和过程化学发光与荧光的区别:化学能光能化学发光反应的条件:反应必须提供足够的激发能焓变(△H)介于170～300kj·mol-1之间