植物生物技术研分子克隆.ppt

基因cI失活基因cI是λ噬菌体的抑制基因，与操纵区oR和oL结合，全面抑制并阻断基因的表达。cI基因的表达促进λ噬菌体进入溶源状态，基因cI产物活性受到影响会促进λ噬菌体进入裂解循环。第37页,共59页，星期六，2024年，5月在带有hfl（高频溶源化，highfrequencyoflysogenization）的E.coli中，λ噬菌体可高效率地进入溶源状态。外源DNA片段插入基因cI中，将高频率地使hfl突变E.coli进入裂解生长状态。在构建基因文库时，可提高排除非重组噬菌体的效率，从而降低对基因文库进行筛选的劳动强度。在hfl突变E.coli中，基因cII产物可以累积到较高水平。基因cII产物为基因cI的正调节物，因此hfl突变可增加基因cI的产物，从而使裂解生长受到抑制，高效地进入溶源状态。第38页,共59页，星期六，2024年，5月Spi筛选Spi+:野生型λ噬菌体在带有P2原噬菌体的溶源性E.coli中的生长会受到限制的表型，称作Spi+，即对P2噬菌体的干扰敏感（sensitivetoP2interference）Spi-：如果λ噬菌体缺少两个参与重组的基因red和gam，同时带有chi位点，并且宿主菌为rec+，则可以在P2溶源性E.coli中生长良好，λ噬菌体的这种表型称作Spi-。通过λ噬菌体载体DNA上的red和/或gam基因的缺失或替换，可在P2噬菌体溶源性细菌中鉴别重组和非重组λ噬菌体。第39页,共59页，星期六，2024年，5月λgt10载体

-43340bp；-缺失了含有溶源整合att位点的片段b527；-在基因N至基因cII替换了一段来自?434噬菌体的片段imm434，其中基因cI内有一个EcoRI位点,其他EcoRI位点都去除掉了；用途：cDNA克隆；允许的插入片段大小为0-6kb常见λDNA载体第40页,共59页，星期六，2024年，5月基因cI内的EcoRI位点作为唯一位点，可用于外源DNA片段的插入。重组后的?gt10变为cI-，很容易用带hflA150突变的宿主菌筛选重组体。cI+λgt10在hflA宿主中进入溶源状态的能力强50～100倍。一般采用宿主菌C600（BNN93）来增殖载体，C600hflA（BNN102）用于筛选重组体cI-λgt10在hflA中形成噬斑cI+在hflA中形成溶源菌，产生混浊噬斑第41页,共59页，星期六，2024年，5月?GEM-2和λGEM-4

由?gt10改造而来，cDNA克隆载体；?GEM-2：43.8kb，可装载0~7.1kb外源片段；λGEM-4：46.2kb，可装载0~4.7kb外源片段?GEM-2与?gt10相比，在cI基因内的EcoRI位点被来自pGEM-1质粒的一小部分片段取代。该小片段含有多克隆位点，在其两端分别有一个SP6和T7噬菌体的启动子，启动子之外各有一个SpeI位点；?GEM-4中，则是将完整pGEM-1质粒替换EcoRI位点。

第42页,共59页，星期六，2024年，5月?gt1143.7kb，允许插入0～7.2kb片段；用于构建cDNA文库、基因组文库和表达融合蛋白；在最左侧可替代区置换了一段lac5基因，可编码?-半乳糖苷酶当外源DNA片段与lacZ的阅读框相吻合时，可表达出融合蛋白，可用免疫学方法筛选阳性重组子。

在IPTG/X-gal平板上形成兰色噬菌斑；lac5基因编码区终止密码子之前有一个EcoRⅠ位点（53bp上游），可用于外源DNA片段的插入，筛选时，在lac-宿主菌中非重组噬菌斑为兰色。第43页,共59页，星期六，2024年，5月带有S基因的琥珀突变Sam100，因此该载体需要在supF宿主菌内进行增殖和筛选。?带有cI基因的温度敏感突变cIts857,该基因产物对温度敏感。一般使用E.coliYl090（hsdR）作为受体菌，用于载体的增殖和文库的筛选；也可用Yl089（hsdR）作为受体菌，该菌具有高频溶源特性，可用于融合蛋白的分析和检测。

在32℃时，cIts857基因产物有活性，可使相应的λ噬菌体处于溶源状态；当温度提高到42℃时，cI