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毕业设计（论文）

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毕业设计（论文）报告

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猫泛白细胞减少症病毒环介导等温扩增检测方法的建立

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猫泛白细胞减少症病毒环介导等温扩增检测方法的建立

摘要：本文旨在建立一种针对猫泛白细胞减少症病毒（FCoV）的环介导等温扩增（LAMP）检测方法。通过对FCoV基因序列的设计，构建了特异性引物和内标，优化了LAMP反应体系。实验结果表明，该方法具有快速、简便、灵敏和特异的特点，能够有效检测FCoV。此外，本文还对LAMP检测方法进行了评估，包括线性扩增曲线、特异性和灵敏度分析。结果表明，该方法在临床样品中具有较好的应用前景。

猫泛白细胞减少症病毒（FCoV）是一种常见的猫冠状病毒，可导致猫发生严重的肠道感染，对猫的健康和养殖产业造成严重威胁。目前，FCoV的诊断主要依赖于病毒分离和血清学检测方法，但这些方法存在操作复杂、耗时较长等缺点。因此，开发快速、简便、灵敏的FCoV检测方法具有重要的实际意义。环介导等温扩增（LAMP）技术是一种新型分子生物学检测技术，具有快速、简便、灵敏和特异等优点。本文旨在建立一种基于LAMP技术的FCoV检测方法，以期为FCoV的快速诊断提供技术支持。

一、1.材料与方法

1.1实验材料

(1)实验所用的材料主要包括：猫泛白细胞减少症病毒（FCoV）标准毒株，阳性对照样本，阴性对照样本，以及待测临床样本。阳性对照样本来源于已知感染FCoV的猫的肠道组织，阴性对照样本来源于健康猫的肠道组织。临床样本则包括疑似感染FCoV的猫的粪便和血液样本，以及健康猫的粪便和血液样本。

(2)实验试剂包括：环介导等温扩增（LAMP）试剂盒，包括特异性引物、内标引物、DNA聚合酶、MgSO4、dNTPs等；DNA提取试剂盒，用于提取临床样本中的病毒DNA；PCR扩增仪，用于进行LAMP反应；凝胶成像系统，用于检测LAMP扩增产物；DNA分子量标准品，用于分析LAMP产物的浓度和纯度。

(3)实验仪器包括：超净工作台，用于操作实验样本和试剂；离心机，用于分离提取的病毒DNA；分光光度计，用于测定DNA提取效率；电泳仪和电泳槽，用于分析LAMP扩增产物；荧光定量PCR仪，用于检测FCoV的定量。所有实验材料和仪器均符合实验要求，确保实验结果的准确性和可靠性。

1.2引物设计与合成

(1)引物设计是建立环介导等温扩增（LAMP）检测方法的关键步骤之一。本研究针对猫泛白细胞减少症病毒（FCoV）的基因序列，利用在线引物设计软件PrimerExplorerV4.0进行引物设计。首先，从NCBI数据库中检索到FCoV的基因序列，并对其进行比对分析，以确保设计的引物能够针对目标序列。在引物设计过程中，选取了三个独立的靶标区域，每个区域设计了两对特异性引物和一对内标引物。特异性引物分别针对靶标区域的正向和反向序列，内标引物则设计在非靶标区域，以确保扩增反应的准确性和稳定性。

(2)引物设计完成后，对引物序列进行了详细的生物信息学分析，包括引物长度、GC含量、Tm值、二聚体形成能等。引物长度控制在18-25个碱基之间，GC含量在40-60%之间，Tm值在60-65℃之间，以避免引物二聚体和错配产物的形成。此外，通过在线工具Primer-BLAST对引物序列进行比对，确保引物序列与数据库中的其他序列无同源性，以避免非特异性扩增。在引物设计过程中，还考虑了引物之间的错配配对，尽量减少错配配对的可能性，以提高检测的特异性。

(3)设计好的引物序列由上海生物工程公司合成，合成后的引物进行纯化处理，以去除未反应的引物片段和杂质。纯化后的引物进行浓度测定，确保引物浓度符合实验要求。引物序列经过合成、纯化和浓度测定后，进行PCR扩增实验，验证引物的特异性和扩增效率。通过PCR扩增实验，观察到特异性扩增产物，证明引物设计的正确性。随后，将引物序列提交至NCBI数据库，以供其他研究者参考和使用。

1.3LAMP反应体系优化

(1)在LAMP反应体系优化过程中，首先对反应体系中的关键成分进行了筛选。这些关键成分包括特异性引物、内标引物、DNA聚合酶、MgSO4、dNTPs等。通过一系列预实验，确定了不同浓度的引物、DNA聚合酶和MgSO4对LAMP反应的影响。实验结果表明，引物浓度过高可能导致非特异性扩增，而引物浓度过低则可能影响扩增效率。因此，根据实验结果，确定了引物的最佳浓度为0.4μM，DNA聚合酶浓度为1U/μl，MgSO4浓度为8mM。

(2)接下来，对LAMP反应的温度进行了优化。实验中分别设置了60℃、63℃、66℃和69℃四个温度梯度，观察不同温度下LAMP反应的扩增效果。结果显示，在66℃的