细胞工程胚胎干细胞培养.ppt

SSEAs(stage-specificembryonicantigen):时期专一性胚胎抗原TRA-1-60、TRA-1-81:肿瘤排斥抗原AKP：碱性磷酸酶在小鼠及灵长类的ES细胞中活性较高，在已分化细胞中活性明显降低；Oct-4:是生殖系专一性转录因子。作为和胚胎发育全能/多能性相关的转录因子，Oct-4通过多种调控机制激活或抑制不同靶基因的转录，在细胞的全能/多能性及未分化状态的调控和维持中发挥重要作用。端粒酶(telomerase):一类核糖核蛋白，与维持真核细胞染色体末端的端粒长度和控制细胞寿命有关。人ES细胞的端粒酶活性高，而分化细胞一般难以检测到；胚胎干细胞的特异性表达标志：第22页，共59页，星期日，2025年，2月5日ES/EG细胞在体外被刺激分化为各种类型细胞是其最基本的属性;ES/EG细胞接种于同一品系的小鼠或免疫缺陷小鼠腹股沟、眼窝、腹腔等可以形成由内胚层、中胚层和外胚层细胞构成的畸胎瘤。胚胎干细胞的体内、外分化特点：第23页，共59页，星期日，2025年，2月5日组织和器官的细胞由含有两个或两个以上基因型构建而成的完整个体称为嵌合体动物（chimaera）。把ES/EG细胞注入胚泡或与桑椹胚聚集，使其与正常胚胎结合在一起，并参与宿主胚胎发育，可形成嵌合体动物的各种组织和器官，包含生殖系嵌合体动物可通过毛色、皮肤颜色等外观指标进行判定或是取器官组织进行同功酶检测(3)嵌合体动物第24页，共59页，星期日，2025年，2月5日三、ES/EG细胞的体外诱导分化第25页，共59页，星期日，2025年，2月5日1、基本原理细胞诱导分化是一个细胞与其微环境相互间复杂而又精密协调的分子细胞学过程，是胚胎正常发育过程中重要而基本的现象；ES细胞是体外研究诱导分化的较理想模型，在体外被诱导分化的途径可能与在体胚胎细胞的不完全相同；在体胚胎的细胞分化过程中，诱导作用的结果不只是决定于各种诱导物质的性质和专一性，同时也决定于被诱导细胞的反应能力(competence)。后者受遗传、发育潜能等内在因素的限制；第26页，共59页，星期日，2025年，2月5日ES细胞体外诱导分化实验中，所用诱导物质繁多，诱导模式不尽相同，按其作用机理大致分为两类：--使被诱导细胞可逆性轻度损伤，导致神经细胞分化无机物、有机酸、醇、亚甲基盐、硫氢化物等--诱导物通过其与被诱导细胞表面的受体结合而诱导细胞分化类固醇激素、维甲酸衍生物、多肽生长因子等同一种诱导物可以诱导出不同类型细胞或变化多端的构造，不仅涉及诱导剂的浓度差别、诱导作用模式和微环境的未知因素等，而且可能与被诱导细胞本身的发育潜能和对诱导剂的反应性等差别有关。第27页，共59页，星期日，2025年，2月5日ES细胞体外诱导分化途径可分为：--谱系分化（lineagedifferentiation），有利于认识组织谱系细胞分化机理和全过程。ES细胞谱系祖细胞谱系定型细胞终末分化细胞--定向分化（committeddiffereniation），需设法控制导向产生单一类型的分化细胞。对ES细胞转染细胞专一的转录因子、标志基因、细胞分化因子结合报告基因和诱导条件选择等手段，探索定向诱导分化途径第28页，共59页，星期日，2025年，2月5日第29页，共59页，星期日，2025年，2月5日第30页，共59页，星期日，2025年，2月5日2、ES细胞体外诱导分化的基本方法单层ES细胞培养和诱导分化：较难分化为单一类型的细胞ES细胞拟胚体形成和诱导分化：相对诱导分化细胞类型较单一,具体方法有：（1）软琼脂培养（2）悬滴培养第31页，共59页，星期日，2025年，2月5日制备ES单细胞悬浮液培养皿盖上接种20ul/滴，直径10cm的培养皿盖盖上带有悬浮细胞小滴的盖子培养皿内加PBS培养皿边缘用膜封置37℃，5％CO2培养箱培养3d后，转移拟胚体至含细胞分化诱导剂的培养皿或微孔板进一步培养然后,移放入铺有0.1%白明胶的培养皿或微孔板内在培养液中再培养可被诱导分化为不同类型细胞ES细胞体外悬滴培养第32页，共59页，星期日，2025年，2月5日3、ES细胞体外诱导分化举例造血细胞内皮细胞与血管神经细胞脂肪细胞心肌和其他肌肉细胞软骨细胞胰岛细胞第33页，共59页，星期日，2025年，2月5日小鼠ES细胞拟胚体在体外可以分化为类似于早期胚胎卵黄囊血岛样的结构并分化产生各种造血系统的细