第六章核酸分子杂交技术讲解.ppt

*基因芯片基因芯片的原理基因芯片的制备基因芯片技术在医学领域的应用 *基因芯片(genechip)又称DNA芯片（DNAchip）或DNA微阵列（DNAmicroarray），将大量的基因片段有序地、高密度地排列在玻璃片或纤维膜等载体上，称之为基因芯片。基因芯片原理该技术是建立在基因探针和杂交测序技术上的一种高效、快速的核酸序列分析手段。*基因芯片制备其分析步骤可分为：芯片的制备样品处理杂交反应检测及数据处理*样品的扩增：在标记和分析前对样品进行适当程度的扩增，以提高阅读灵敏度；待测样品的标记：多采用荧光标记方法，对于阵列密度较小的基因芯片可以用同位素检测法。基因芯片制备-样品的处理*cDNA基因芯片与靶基因的杂交过程与常规的分子杂交过程基本相同；用于检测基因表达，较长的杂交时间，高的严谨性，高的样品浓度和低温度；用于突变检测，因要鉴别出单碱基错配，需要更高的杂交严谨性和更短的时间。基因芯片制备-杂交反应*检测方法很多，如荧光显影法、质谱法、化学发光和光导纤维等。检测系统主要由信号产生、信号收集及传输、信号处理及成像三个部分组成。使用最广泛的是荧光显影法。基因芯片制备-结果检测分析*基因芯片的制备-固相载体固体片状材料主要有玻片、硅片和瓷片等；固体膜性材料有硝酸纤维素膜、聚丙烯膜以及尼龙膜等。*基因芯片的制备-分型按固体支持物不同，基因芯片可分为：薄膜型、玻片型、微板型、集成电路型、微通道型等；近年基因芯片技术结合微电极技术、微型聚乙烯酰胺凝胶技术、高速微通道技术制备出了电子芯片（Electronicbiochip）、三维芯片（three-dimensionalbiochip）、流过式芯片(flow-throughbiochip)等新型芯片。*点样探针：基因组探针、cDNA探针以及寡核苷酸探针；载体表面的活化主要是涂布多聚赖氨酸或者包被氨基硅烷偶联试剂，使载体表面带有羟基或者氨基等活性基团。合成点样过程：机械臂将不同探针样品定量(0.25～1.0μl)点样于预处理好的基板相应位置上，在基板上产生直径为100～150μm斑点，再由紫外线交联固定后即得到DNA微阵列或芯片。基因芯片的制备-合成点样*点样装置的不同分为：打印法合成点样及其喷印法合成点样；打印法的优点是探针密度较高，1平方厘米通常可打印2,500个探针。缺点是定量准确性及重现性不好，打印针易堵塞。喷印法的优点是定量准确，重现性好，使用寿命长。缺点是喷印的斑点大，因此探针密度低，1平方厘米通常只可喷印400个探针。基因芯片的制备-合成点样*基因芯片的原位合成法是基于组合化学的合成原理，它通过一组定位模板来决定基片表面上不同化学单体的偶联位点和次序，如要合成AGCT四种碱基所有序列组合，其流程见图基因芯片的制备-原位合成基因芯片原位合成原理示意图*分子印章技术（MolecularStamps）该技术是一种软光刻技术，分子印章是一种表面有微结构的硅橡胶模板，该方法特点是分辨率、准确率以及产率高。基因芯片的制备-分子印章原位合成*光引导聚合技术（Light-directedsynthesis）又称原位光刻技术，是应用最广的原位合成技术，它不仅可用于寡聚核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子；光引导聚合技术是照相平板印刷技术与成熟且已自动化的核酸、多肽固相合成技术相结合的产物。基因芯片的制备-光引导聚合原位合成*原位喷印合成(Ink-JetPrintingsynthesis)，原理及其过程与喷墨打印类似，不过芯片喷印头和墨盒有多个，其中墨盒中装的是四种碱基液体，喷印头可在整个芯片上移动，并根据芯片上不同位点探针的序列需要，将特定碱基喷印在芯片的特定位置；该技术采用的原理与传统的DNA固相合成相一致，无需特殊的化学试剂。基因芯片的合成方式-原位喷印合成*内容原位合成法预合成后点样法方式原位化学合成探针收集，显微打印探针类型寡核苷酸cDNA、基因片段、寡核苷酸、RNA最高集成度10～40万点/cm21～4万点/cm2探针长度短，小于50个碱基较长，100～500个碱基或更长杂交过程条件要求高，不易控制条件要求低，较易控制原位合成法与合成点样方式的比较基因芯片的合成方式*基因芯片技术的基本应用可以分为两个主要方面：定量分析（主要指测序和突变检测）定性分析（主要指对基因表达的研究）。基因芯片技术在医学领域的应用*（一）基因表达水平的检测（二）基因突变和多态性的检测（三）基因芯片在药物筛选中的应用（