《荧光定量PCR培训》课件.pptVIP

*******************荧光定量PCR培训本课程将带您深入了解荧光定量PCR技术，从原理到应用，从实验操作到数据分析，帮助您掌握这项重要技术，为您的科研工作提供有力支持。课程目标了解荧光定量PCR原理掌握荧光定量PCR技术基础知识，熟悉其在生物学研究中的应用。熟练操作荧光定量PCR仪器掌握荧光定量PCR实验的各个步骤，包括样本准备、反应体系配置、仪器操作、数据分析等。独立进行荧光定量PCR实验能够根据实验设计，选择合适的荧光探针、引物、反应条件，并独立完成实验。PCR原理复习1DNA变性高温使DNA双链解开2引物退火引物与模板DNA结合3DNA延伸DNA聚合酶合成新的DNA链4循环重复重复以上步骤，使DNA数量指数增加荧光PCR技术基础1实时监测通过荧光信号实时监测PCR扩增过程，无需进行后续电泳分析2定量分析根据荧光信号强度，精确地定量分析目标基因的表达水平3高灵敏度可检测到极低浓度的目标基因，提高实验的灵敏度和准确性荧光探针类型TaqMan探针基于核酸酶的作用原理，探针被降解后发出荧光信号SYBRGreen探针与双链DNA结合后发出荧光信号，可用于检测任何DNA片段反应体系组成模板DNA待测目标基因的DNA序列引物用于引导DNA聚合酶合成目标片段dNTPsDNA合成的原料，包含A、T、G、C四种脱氧核苷酸缓冲液提供合适的pH值和离子浓度，维持反应条件稳定MgCl2为DNA聚合酶提供所需的镁离子荧光探针用于检测目标基因的扩增产物DNA聚合酶催化DNA链的合成反应体系优化1模板浓度确定最佳模板浓度，避免抑制或过载2引物浓度找到合适的引物浓度，确保引物效率和特异性3MgCl2浓度优化MgCl2浓度，保证酶活性并提高扩增效率4退火温度选择合适的退火温度，提高引物与模板的结合效率引物设计要点特异性引物应特异性地与目标基因序列结合，避免与其他基因序列发生交叉反应效率引物应具有良好的扩增效率，确保在相同循环数下得到足够的扩增产物长度引物长度一般为18-30个碱基，过长或过短都会影响扩增效率GC含量引物GC含量一般为40-60%，过高或过低都会影响退火温度模板DNA选择基因组DNA适用于检测全基因组水平的基因表达cDNA适用于检测mRNA水平的基因表达，需要先进行逆转录质粒DNA适用于检测质粒载体中的基因表达DNA提取及纯化1样本收集根据实验目的，选择合适的样本类型，如血液、组织、细胞等2细胞裂解使用裂解液破坏细胞结构，释放出DNA3DNA沉淀加入乙醇等试剂使DNA沉淀，分离出DNA4DNA洗涤去除杂质，纯化DNA5DNA溶解将DNA溶解在合适的缓冲液中标准曲线制备10^610^6高浓度标准品10^510^5中度浓度标准品10^410^4低浓度标准品引物效率评估反应条件优化退火温度优化退火温度，提高引物与模板的结合效率循环次数确定合适的循环次数，确保目标基因的扩增达到最佳状态反应时间优化反应时间，提高扩增效率和特异性扩增曲线解析基线阶段荧光信号很弱，几乎无法检测到指数增长阶段荧光信号快速增加，目标基因指数扩增平台期荧光信号达到饱和，目标基因扩增接近完成Ct值判读Ct值循环阈值，荧光信号超过阈值时所对应的循环次数相对定量分析内参基因选择稳定表达的基因作为内参，用于校正样本间的差异2^-ΔΔCt法利用内参基因校正目标基因的表达量，比较不同样本间的差异绝对定量分析1标准曲线使用已知浓度的标准品绘制标准曲线2Ct值根据未知样本的Ct值，通过标准曲线计算目标基因的浓度结果数据分析数据整理将实验数据整理成表格或图表，方便分析统计分析进行t检验、方差分析等统计分析，验证实验结果的可靠性图表绘制绘制柱状图、折线图等图表，直观地展示实验结果常见问题分析无扩增信号模板质量差，引物设计错误，反应条件不合适扩增曲线异常反应体系污染，样本质量不佳，仪器故障Ct值不稳定引物效率低，反应条件不稳定，样本间差异大实验结果质量控制1阴性对照确保反应体系无污染2阳性对照验证反应体系的有效性3重复实验提高实验结果的可靠性4标准曲线验证定量结果的准确性仪器维护保养定期清洁清洁仪器表面和内部，保持仪器清洁卫生更换耗材定期更换反应板、试剂盒等耗材，确保实验结果准确校准仪器定期校准仪器，确保仪器运行正常实验注意事项11严格遵守实验操作规范，防止污染22使用高质量的试剂和耗材，确保实验