高效液相色谱简介及操作.ppt

色谱柱是高效液相色谱的心脏。柱管多用不锈钢制成。两端的柱接头内装有筛板，防止填料漏出。填料的粒度多为0.2-20μm(5-10μm)。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。常规分析柱：内径2~5mm(常用4.6mm，3.9mm)，柱长10~30cm(15cm，25cm居多）。3分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。第23页，共35页，星期日，2025年，2月5日4检测系统主要作用：监测经色谱柱分离后的组分浓度变化，并由工作站记录数据，定性、定量分析。高效液相色谱常用的检测器有紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器等。第24页，共35页，星期日，2025年，2月5日原理：朗伯-比尔定律a.紫外检测器(UVD)：应用最广泛的检测器。特点：使用面广；灵敏度高（检测下限为10-10g／ml）；线性范围宽；对温度和流速变化不敏感；可检测梯度溶液洗脱的样品。缺点：只能检测有紫外吸收的物质，流动相的截止波长应小于检测波长。第25页，共35页，星期日，2025年，2月5日第1页，共35页，星期日，2025年，2月5日一、高效液相色谱概述及原理高效液相色谱法（HPLC）是在20世纪70年代在经典液相色谱和气相色谱的基础上迅速发展起来的一种高效、快速的分离分析技术。第2页，共35页，星期日，2025年，2月5日1.色谱的演化色谱：由于不同的组分与固定相作用强弱不同，在一定的推动力下，它们在固定相中滞留的时间长短不一，从而使它们按一定顺序从色谱柱中先后流出。经典的柱色谱经典的柱色谱第3页，共35页，星期日，2025年，2月5日渐渐地，人们以传统色谱为蓝本开发了气相色谱气相色谱示意图经典的柱色谱第4页，共35页，星期日，2025年，2月5日高效液相色谱：效仿气相色谱，用高压输液泵将流动相输入高柱效色谱柱，使其在柱内快速流动，并在柱末端附加检测器检测分离情况。高效液相色谱就这样诞生了。第5页，共35页，星期日，2025年，2月5日高效液相色谱仪就这样诞生了LCGCHPLC第6页，共35页，星期日，2025年，2月5日填料颗粒小（2~10μm），受到的阻力较大，为了能迅速地通过色谱柱，必须对载液施加15~30MPa的高压。由于采用高压，载液在色谱柱内的流速可达l~10mL／min，因而所需分析时间少。使用细、规则、孔浅的颗粒做为固定相，分离效率大大提高。采用紫外、荧光、蒸发激光散射、电化学、质谱等检测器，检测灵敏度高。紫外检测器检测限可达0.01ng；荧光和电化学检测器可达0.1pg。2.为什么叫高效液相色谱???第7页，共35页，星期日，2025年，2月5日HPLC和经典液相色谱法的比较第8页，共35页，星期日，2025年，2月5日3.高效液相色谱法的分类通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分配色谱法、离子色谱法和凝胶色谱法四大类。第9页，共35页，星期日，2025年，2月5日4.如何阅读色谱图？？tR：保留时间；tM：死时间；：调整保留时间；W：峰宽第10页，共35页，星期日，2025年，2月5日定性分析：在同一色谱系统中相同物质具有相同的保留值定量分析：组分含量与其响应值（峰高或面积）成正比第11页，共35页，星期日，2025年，2月5日5.如何评价色谱峰？？柱效：描述被分离组分的集中程度。柱效越高，组分越集中，对应色谱峰的峰宽越窄。可用理论塔板高度H描述。H越小，柱效越高。选择性：描述不同组分的分离程度。选择性越高两个色谱峰顶相距越远。用R表示第12页，共35页，星期日，2025年，2月5日（a）柱效和分离度都不好；（b）分离度高，柱效低；（c）理想色谱峰第13页，共35页，星期日，2025年，2月5日用分离度R可以描述选择性和柱效的总效能R值越大，表明两组分的分离程度越高，R=1.0时，分离程度可达98%，R1.0时两峰有部分重叠，R=1.5时，分离程度达到99.7%.所以，通常用R=1.5作为相邻两色谱峰完全分离的指标.第14页，共35页，星期日，2025年，2月5日分析未知物质------联用技术色谱-质谱联用色谱-核磁共振联用色谱-傅氏转换红外线光谱分析仪联用第15页，共35页，星期日，2025年，2月5日二、高效液相色谱仪的结构液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、分离系统以及检测和记录系统四大部分组成。此外，可根据需要配置流动相在线脱气装置、梯度洗脱装置、自动进样系统、柱后反应系统和全自动控制系统等。