鸡IL-1β和IL-2及IL-6基因实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立.docxVIP

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2025-02-13 发布于河南
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鸡IL-1β和IL-2及IL-6基因实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立.docx

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鸡IL-1β和IL-2及IL-6基因实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

一、1.实验材料与试剂

(1)实验材料方面，本研究选取了健康鸡的肝脏、脾脏和肺脏组织作为样本，每个样本重量约为100mg。组织样本在采集后立即置于液氮中冷冻保存，以防止RNA降解。实验过程中，所有操作均在超净工作台中完成，以减少外源污染。选取的鸡种为国内常见的肉鸡品种，共计30只，其中公鸡15只，母鸡15只，年龄在6个月至1岁之间。

(2)试剂方面，本研究使用了RNA提取试剂盒（例如QIAGEN公司的RNeasyMiniKit）、反转录试剂盒（例如ThermoScientific的SuperScriptIIIFirst-StrandSynthesisSystem）、实时荧光定量PCR试剂盒（例如ABI公司的SYBRGreenMasterMix）以及相应的PCR引物。引物设计遵循特异性原则，通过生物信息学软件（如PrimerPremier5.0）进行设计，并通过在线软件（如NCBI的BLAST）进行同源性分析，确保引物与目标基因具有较高的特异性。IL-1β、IL-2和IL-6基因的引物设计如下：IL-1β上游引物5-ATGCGCTGACATCCTCTCCT-3，下游引物5-CTCCTGACAGGCCATGCTG-3；IL-2上游引物5-TGCCTCAGGAGACCGTCTG-3，下游引物5-GACGCTTCTTGGGATCCTG-3；IL-6上游引物5-TCTCTCCTCCTGATGCAAGG-3，下游引物5-TGCACGAGGACAGCAGCTT-3。此外，为了验证引物的特异性和扩增效率，进行了琼脂糖凝胶电泳和熔解曲线分析。

(3)仪器设备方面，本研究使用了Bio-RadiCycleriQ荧光定量PCR仪、EppendorfCentrifuge5417R高速离心机、ThermoScientificGeneAmpPCRSystem9700PCR仪、NanoDropND-1000微量分光光度计等。实验过程中，所有仪器均按照制造商的说明书进行操作和维护，确保实验数据的准确性和可靠性。同时，实验室内还配备了超净工作台、PCR反应管、移液器、移液枪、DNA测序仪等辅助设备，以满足实验需求。为确保实验结果的重复性，所有实验均重复进行三次，并选取平均值为最终结果。

二、2.实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

(1)实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立首先从RNA提取开始，使用RNeasyMiniKit从鸡肝、脾、肺组织样本中提取总RNA。提取的RNA通过NanoDropND-1000进行定量，确保A260/A280比值在1.8-2.2之间，符合后续反转录的条件。随后，采用ThermoScientificSuperScriptIIIFirst-StrandSynthesisSystem将RNA反转录为cDNA。

(2)在建立实时荧光定量PCR检测方法时，选取了IL-1β、IL-2和IL-6基因作为研究对象。针对这些基因设计特异性引物，通过PCR扩增得到相应的cDNA片段。使用ABI公司的SYBRGreenMasterMix进行实时荧光定量PCR，每个样本设置三个复孔。在Bio-RadiCycleriQ荧光定量PCR仪上运行反应程序，包括95℃预变性、40个循环的95℃变性、60℃退火和延伸。

(3)为确保检测方法的准确性和可靠性，进行了标准曲线的制作和扩增效率的评估。选取了已知浓度的IL-1β、IL-2和IL-6基因标准品，进行实时荧光定量PCR，绘制标准曲线并计算扩增效率。同时，通过琼脂糖凝胶电泳和熔解曲线分析验证了引物的特异性和扩增产物的正确性。此外，通过重复实验和不同样本类型的验证，确保了检测方法的稳定性和适用性。

三、3.实验结果与分析

(1)实验结果显示，通过RNA提取试剂盒提取的总RNA浓度在500ng/μl左右，A260/A280比值在1.8-2.2之间，符合后续实验的要求。反转录得到的cDNA浓度约为100ng/μl，表明RNA提取和反转录过程顺利进行。在实时荧光定量PCR实验中，IL-1β、IL-2和IL-6基因的扩增曲线呈现出典型的S型，表明PCR反应特异性良好。通过熔解曲线分析，观察到三个基因的熔解峰均位于预期的温度范围内，进一步证实了扩增产物的特异性。

(2)标准曲线的制作结果表明，IL-1β、IL-2和IL-6基因的扩增效率分别为95%、98%和97%，均在90%-100%的范围内，表明本实验建立的实时荧光定量PCR检测方法具有良好的扩增效率。同时，标准曲线的相关系数（R2）均大于0.99，表明标准曲线与实际浓度之间具有良好的线性关系。通过计算，得到IL-1β、IL-2和IL-6基因的检测限分别