三维细胞培养简介闫辉课件.pptx

闫辉

目录

4三维细胞培养模型的建立4.1三维基质胶〔2〕的种类以及常用基质胶的介绍4.2三维模型的种类4.3常见三维细胞培养模型的建立方法

目前已经知道的基质胶主要有海藻酸钙凝胶、琼脂糖凝胶，这两种凝胶主要适用于悬浮细胞的培养，还有一种是血纤维蛋白，将动物细胞和血纤维蛋白原混合，然后参加凝血酶。凝血酶将血纤维蛋白原转化为不溶性的血纤维蛋白，将动物细胞固定在其中。血纤维蛋白可以促进细胞贴壁，因此无论是悬浮细胞还是贴壁细胞都适合。

实验室大量使用的基质胶是Matrigel胶，是从小鼠肿瘤组织中提取的抽提物，在室温下，Matrigel可自动聚集产生类似于哺乳动物细胞基底膜的生物活性基质材料。Matrigel基底膜基质形成的三维培养基质，可促进上皮细胞、肝细胞、Sertoli细胞、黑色素瘤细胞、血管内皮细胞、甲状腺细胞及毛囊细胞等的贴壁与分化。同时，Matrigel还能影响乳腺上皮细胞的蛋白表达，支持外周神经的新生和牛输卵管上皮细胞的分化。高浓度的Matrigel适用于研究体内血管生成和肿瘤细胞迁移及肿瘤模型的建立等。

4.2三维细胞培养模型的种类三维立体培养的方法有多种，常用的有胶内培养模式(细胞与胶原胶混合)、胶上培养模式(细胞生长于胶原胶外表)和三明治培养模式(细胞生长于两层胶原中间)。

4.2常见三维细胞培养模型的建立方法

胶内培养模式的建立方法Matrigel母液浓度10.6mg/mL〔3〕,放置于4℃溶解(4)。消化细胞,重悬至完全培养基中计数,细胞悬液浓度为1×106/mL。使用时置于冰上,用预冷的细胞重悬液与Matrigel等体积混匀,24孔板中每孔参加100μl。37℃放置30min使其成胶,添加完全培养液。置于37℃5%CO2细胞培养箱中孵育,第二日换液,此后每隔一日换液一次[1]。

胶上培养模式的建立方法在24孔培养板中每孔参加75μl冰上过夜解冻的Matrigel，置于37℃孵箱中孵育15min以上使Matrigel聚集。同时胰酶消化常规培养的正常鼻咽细胞及其高转移潜能亚株5-8F,计数后离心收集细胞.然后把细胞悬浮于含2%Matrigel的Keratinocyte-SFM培养液中，细胞浓度为2*104/ml用加样枪吹打成单个细胞后,每孔参加400μl细胞悬液于已经凝固的Matrigel上，置于含5%CO2的37℃孵箱中培养，每3-4天换新鲜培养液[2]。

三明治培养模型的建立方法三明治模式前期工作和凝胶上模式相同,不同之处在于凝胶上的细胞经培养融合至(70、80)%左右时,吸去培养液,用无菌PBS冲洗两次后添加第二层胶(200μl/孔),在37℃下培养30min使其凝固后,再在胶原凝固面上添加培养液[3]。

三种模型的简单解释

4.3不同模型的比较对于胶上培养模式，细胞可以黏附于细胞外基质外表并向再造基质胶中生长，但是只有贴近Matrigel胶的细胞才能得到固体细胞外基质的支撑，其他不能贴近再造基质胶的细胞仍然处于2D培养条件下，在培养过程中不能形成完全的立体克隆；对于胶内培养模式，细胞直接重悬于完全融化的Matrigel胶条件下，细胞生长于完全固态的细胞外基质中，可以很好地模拟体内肿瘤细胞生长微环境，在培养过程中形成了巨大的、无极性的球状细胞克隆。所以大多数的实验建立三维模型采用胶内培养模式，但相对来说胶上培养模式简单一些，对于操作的要求低一些。三种模型共同的缺点是无法对细胞直接利用显微镜进行连续的观察，需要对某一特定时间的胶原块进行固定制作电镜标本。

BCA2D细胞培养模型B细胞生长于Matrigel胶外表C细胞重悬于Matrigel胶中[4]

5.1肿瘤生物学三维细胞培养已被广泛运用到肿瘤学研究,在肿瘤的实验性治疗、肿瘤的侵袭性、转移和中心坏死的机制、肿瘤的血管形成和营养供给、体内基因表达的模拟等方面发挥了不可替代的作用[5]。同时可以研究不同细胞间的相互作用，观察两种不同的细胞类型是否融合或是不相关地各自生长

5.2软骨和骨组织成熟的软骨细胞和干细胞被广泛用于三维细胞培养,以再生损伤的软骨、骨、韧带、肌腱和膝关节半月板。在培养系统中常参加一些生长因子,以刺激分化,产生组织.5.3循环系统和心脏各组织都配备有大小各异的血管。如何在成熟的组织中及时产生血管网络是组织工程的重要课题;在治疗领域,所关心的也是如何有目的地改变血管形成,利用三维培养可以清楚地观察到细胞通过空间增殖、迁移和锚定,最终形成管状结构。

注释

〔2〕基质胶可认为是一种可溶性的基底膜基质。主要成分包括：层黏连蛋白、胶原IV等，同时含TGF-β成纤维细胞生长因子、组