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细胞传代致弱的禽偏肺病毒JC毒株致病性变化的研究

一、引言

(1)禽偏肺病毒（AvianInfluenzaVirus，AIV）是一种重要的禽类传染病病原体，其引起的禽类呼吸道疾病对全球养禽业造成了巨大的经济损失。AIV中的JC毒株是其中一种常见的致病株，具有高度的致病性和变异性。在病毒学研究领域，对AIV的研究主要集中在病毒基因型、病毒致病机制以及免疫逃逸策略等方面。随着实验技术的不断进步，细胞传代致弱技术逐渐成为研究病毒致病性的重要手段之一。

(2)细胞传代致弱是指通过连续传代培养病毒，使其逐渐失去致病能力，同时保留其生物学特性。这种方法在病毒疫苗研发和病毒致病性研究中具有重要意义。研究表明，细胞传代致弱后的病毒株在生物学特性上与野生型病毒存在显著差异，如病毒滴度降低、组织细胞病变程度减轻等。以AIVJC毒株为例，通过细胞传代致弱技术获得的致弱株在禽类体内实验中表现出较低的致病性，为禽流感疫苗的研发提供了新的思路。

(3)近年来，关于细胞传代致弱对病毒致病性影响的研究不断深入。研究发现，致弱过程中病毒基因型、病毒蛋白表达水平以及病毒与宿主细胞相互作用等方面均发生了一系列变化。例如，细胞传代致弱后的AIVJC毒株在病毒基因型上发生了变异，导致病毒蛋白表达水平降低，进而影响了病毒与宿主细胞的相互作用。此外，致弱过程中病毒颗粒的形态和大小也发生了变化，这些变化均对病毒的致病性产生了重要影响。因此，深入探究细胞传代致弱对病毒致病性的影响，对于理解病毒致病机制、开发新型疫苗以及控制禽流感疫情具有重要意义。

二、实验材料与方法

(1)实验材料包括AIVJC毒株、MDCK细胞系、DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、抗生素混合物、细胞培养箱、超净工作台、显微镜、酶标仪、细胞培养板、病毒培养瓶、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统等。AIVJC毒株由我国某研究机构提供，MDCK细胞系购自美国典型培养物保藏中心。实验前，将病毒液和MDCK细胞分别进行复苏，并在细胞培养箱中37℃、5%CO2条件下进行常规培养。

(2)病毒传代致弱实验采用细胞培养方法。首先，将MDCK细胞接种于细胞培养板中，待细胞贴壁生长至80%左右，用胰蛋白酶消化后按1:10的比例传代。然后，将病毒液接种于MDCK细胞培养板中，37℃、5%CO2条件下吸附1小时，弃去病毒液，加入新鲜DMEM培养基，继续培养。观察细胞病变情况，当细胞出现明显病变时，收集病毒液，按1:10的比例进行传代。重复上述过程，连续传代10次，获得致弱病毒株。

(3)病毒致病性实验采用鸡胚接种和鸡只感染模型。首先，将致弱病毒株和野生型AIVJC毒株分别接种于10日龄SPF鸡胚尿囊腔中，37℃条件下孵化。观察鸡胚死亡情况和尿囊液病毒滴度。其次，将10日龄SPF鸡随机分为三组，每组10只，分别接种致弱病毒株、野生型AIVJC毒株和空白对照组。观察鸡只临床表现、死亡情况以及血清学检测结果。同时，采用PCR技术检测病毒基因型，通过Westernblot检测病毒蛋白表达水平，以评估病毒致病性变化。实验数据采用SPSS软件进行统计分析。

三、结果与分析

(1)经过连续10次传代后，AIVJC毒株的细胞病变程度明显降低，病毒滴度也随之下降。通过PCR检测，发现致弱株与野生型病毒株在基因型上存在一定差异，部分基因片段发生了突变。Westernblot结果显示，致弱株的病毒蛋白表达水平较野生型病毒株显著降低。

(2)在鸡胚实验中，致弱病毒株接种的鸡胚死亡率低于野生型病毒株，且尿囊液病毒滴度也明显降低。这表明致弱病毒株的致病性较野生型病毒株有所减弱。在鸡只感染实验中，致弱病毒株接种的鸡只表现出较轻的临床症状，如呼吸加快、食欲减退等，死亡率低于野生型病毒株。血清学检测结果也显示，致弱病毒株接种的鸡只抗体滴度较低。

(3)致弱病毒株与野生型病毒株在基因型上的差异可能导致了病毒蛋白表达水平的降低，进而影响了病毒的致病性。此外，病毒与宿主细胞的相互作用也是影响病毒致病性的重要因素。在致弱过程中，病毒与宿主细胞的相互作用可能发生了变化，从而导致病毒致病性的降低。本研究结果为禽流感疫苗研发和病毒致病机制研究提供了新的理论依据。

四、讨论与结论

(1)本研究通过细胞传代致弱技术，成功降低了AIVJC毒株的致病性。实验结果显示，致弱病毒株的细胞病变程度、病毒滴度和鸡胚死亡率均显著低于野生型病毒株。这与前人研究结果一致，表明细胞传代致弱技术是降低病毒致病性的有效方法。在禽流感疫苗研发中，这一技术有望为疫苗的安全性提供保障。

(2)致弱病毒株在基因型上与野生型病毒株存在一定差异，部分基因片段发生了突变。这些突变可能导致了病毒蛋白表达水平的降低，从而影响了病毒的致病性。本研究中，致弱病毒株的病毒蛋白表达水平较野生型病