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用牛津杯法测定益生菌的抑菌活力

一、实验原理

(1)益生菌抑菌活力测定是评估益生菌对特定病原菌抑制能力的重要方法。牛津杯法（Oxoiddiscdiffusionmethod）是一种常用的抑菌活性测定技术，其原理基于微生物对抑菌物质的敏感性差异。该方法通过在含有特定微生物的培养基上放置含有不同浓度抑菌物质的牛津杯，观察抑菌圈的大小来判断抑菌物质的活性。抑菌圈的大小与抑菌物质的浓度呈负相关，即抑菌圈越大，抑菌活性越强。例如，在测定某益生菌对金黄色葡萄球菌的抑菌活性时，抑菌圈直径大于15mm表示该益生菌对该菌株具有较强的抑菌作用。

(2)牛津杯法测定益生菌抑菌活力实验中，常用的抑菌物质包括抗生素、天然产物和益生菌代谢产物等。抗生素如青霉素、链霉素等，天然产物如大蒜素、茶多酚等，以及益生菌产生的细菌素等均具有抑菌作用。实验中，抑菌物质的浓度通常设置成梯度，以便观察不同浓度下抑菌圈的变化。例如，在测定大蒜素对大肠杆菌的抑菌活性时，大蒜素浓度从10mg/mL递减至0.1mg/mL，通过观察抑菌圈直径的变化，可以确定大肠杆菌对大蒜素的最小抑菌浓度（MIC）。

(3)牛津杯法在益生菌抑菌活力测定中的应用具有广泛性。例如，在食品工业中，通过测定益生菌对食品中常见病原菌的抑菌活性，可以评估益生菌在食品防腐中的作用。在医药领域，益生菌的抑菌活性研究有助于开发新型抗菌药物和益生菌制剂。此外，牛津杯法在环境监测中也具有应用价值，如检测益生菌对水体中病原菌的抑制效果，有助于控制水环境中的微生物污染。在实际应用中，通过牛津杯法可以快速、简便地评估益生菌的抑菌活性，为益生菌产品的研发和应用提供科学依据。

二、实验材料与仪器

(1)实验材料包括益生菌菌株、病原菌菌株、营养培养基、牛津杯、抑菌物质、无菌生理盐水、无菌水、移液枪、显微镜、酒精灯、高压蒸汽灭菌器、电子天平、恒温培养箱、无菌操作台等。以测定某益生菌对大肠杆菌的抑菌活性为例，所需的实验材料包括：大肠杆菌菌株、M-H琼脂培养基、氨苄西林牛津杯、无菌生理盐水、移液枪、恒温培养箱等。

(2)实验仪器包括显微镜、电子天平、高压蒸汽灭菌器、无菌操作台、恒温培养箱、牛津杯放置装置、移液枪、酒精灯、加热器、pH计等。在实验过程中，显微镜用于观察微生物的生长状况；电子天平用于称量实验材料；高压蒸汽灭菌器用于灭菌培养基和实验器材；无菌操作台提供无菌操作环境；恒温培养箱用于培养微生物。

(3)实验中使用的牛津杯直径为6mm，抑菌物质如氨苄西林的浓度梯度为2mg/mL至128mg/mL。实验过程中，需使用移液枪准确移取抑菌物质和益生菌菌液。此外，实验过程中需注意无菌操作，避免微生物污染。例如，在制备培养基时，需将培养基和牛津杯在高压蒸汽灭菌器中灭菌，以确保实验结果的准确性。

三、实验方法

(1)实验前，首先将益生菌菌株和病原菌菌株分别进行活化。将益生菌菌株接种于MRS液体培养基中，在37℃恒温培养箱中培养18-24小时；将病原菌菌株接种于LB液体培养基中，在37℃恒温培养箱中培养16-18小时。活化后的菌株用无菌生理盐水进行梯度稀释，得到不同浓度的菌悬液。

(2)准备M-H琼脂培养基，按照1:10的比例加入无菌蒸馏水，在100℃水浴中加热溶解，待培养基冷却至50-55℃时，加入氨苄西林牛津杯，每份培养基加入6个牛津杯。将培养基倒入无菌平板中，待凝固后，用无菌移液枪吸取适量益生菌菌悬液，均匀涂布于平板表面。

(3)将病原菌菌悬液用无菌移液枪吸取适量，滴加于平板上的益生菌菌落周围，形成直径约1cm的菌落。将平板置于37℃恒温培养箱中培养24小时，观察抑菌圈的形成情况。记录抑菌圈直径，计算抑菌圈直径与抑菌物质浓度的关系。例如，在测定某益生菌对金黄色葡萄球菌的抑菌活性时，将金黄色葡萄球菌菌悬液滴加于平板上的益生菌菌落周围，观察抑菌圈直径变化，记录抑菌圈直径与氨苄西林浓度的关系。

(4)为了进一步验证实验结果，可以设置以下对照组：①不含抑菌物质的对照组；②仅含有氨苄西林的对照组；③仅含有益生菌的对照组。通过比较不同对照组的抑菌圈直径，可以排除其他因素对实验结果的影响。例如，在测定某益生菌对大肠杆菌的抑菌活性时，设置不含氨苄西林的M-H琼脂培养基作为对照组，以排除氨苄西林本身对大肠杆菌的抑制作用。

(5)实验过程中，还需注意以下几点：①实验操作应在无菌条件下进行，避免微生物污染；②牛津杯应均匀分布在平板上，避免抑菌物质浓度不均；③实验结果应以抑菌圈直径为指标，计算抑菌物质的最低抑菌浓度（MIC）；④实验重复次数不少于3次，以确保实验结果的可靠性。例如，在测定某益生菌对沙门氏菌的抑菌活性时，重复实验3次，计算平均抑菌圈直径，以确定该益生菌对沙门氏菌的抑菌活性。

四、结果分析与讨论

(1)在本次实验中，