蛋白质的提取纯化和分析.ppt

关于蛋白质的提取纯化和分析第1页，共25页，星期日，2025年，2月5日材料选择和预处理细胞破碎蛋白质的粗提目录题目分析蛋白质的纯化分析检测第2页，共25页，星期日，2025年，2月5日1题目解析已知某蛋白的分子量约为17kDa，等电点3.9~4.1，它能耐一定的高温，在90°C加热3~4min后仍然能够保持80%的活性。该蛋白含有较多的疏水性残基，与Ca2+结合后可以暴露它的疏水基团。该蛋白的作用是作为生物体内酶的激活剂。在钙离子的作用下才能起到暴露疏水集团发挥性能，结合蛋白质基础知识从而可以判断其为钙调蛋白。第3页，共25页，星期日，2025年，2月5日材料的选择TEXT材料的预处理成年健康雄性大鼠脑组织20克（比雌鼠体积大，成本较低物种易获得）将切取的组织用4℃预冷0.01mol/l的PBS漂洗去血渍，再用滤纸吸干残留的PBS（磷酸盐缓冲液）第4页，共25页，星期日，2025年，2月5日预处理过的组织细胞破碎（高速珠磨法）制备组织细胞悬液（剪碎法）蛋白质被释放出来331122破碎第5页，共25页，星期日，2025年，2月5日剪碎法1.将组织块放入平皿后，加入少量PBS；2.用眼科剪将组织剪至匀浆状，加入10mlPBS；3.用吸管吸取组织匀浆，用200目尼龙网过滤到试管内；返回第6页，共25页，星期日，2025年，2月5日高速珠磨法破碎机理：高速珠磨法是一种有效的细胞破碎方法，珠磨机是该法所用的设备，其结构示意图见图（1）。微生物细胞悬浮液与极细的研磨剂在搅拌桨作用下充分混合，珠子之间以及珠子和细胞之间的互相剪切、碰撞促进细胞膜破裂，释出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出，从而实现连续操作。破碎中产生的热量由夹套中的冷却液带走。第7页，共25页，星期日，2025年，2月5日钙调蛋白的粗提取抽提蛋白质破碎后，使用适当的溶剂，将蛋白质提取溶解到溶剂当中，常用稀酸、稀碱、有机溶剂等电点3.9~4.1酸性蛋白质稀碱性溶液抽提溶液碱性的程度，碱性过大则难以复性pH调至等电点偏碱的一侧（4.1）第8页，共25页，星期日，2025年，2月5日粗提取物离心操作除去固体杂质的上清液第9页，共25页，星期日，2025年，2月5日热变性初步纯化天然结构%钙调蛋白一般蛋白100℃热稳定性不同第10页，共25页，星期日，2025年，2月5日其他方法盐析法等电点法有机溶剂法第11页，共25页，星期日，2025年，2月5日3蛋白质的精纯和分析鉴定第12页，共25页，星期日，2025年，2月5日亲和色谱配体蛋白质蛋白质和配体复合物交联试剂载体配体载体与配体交联体杂质杂质游离配体洗脱结合耦联作用机理第13页，共25页，星期日，2025年，2月5日金属螯合亲和层析钙调蛋白的外形似哑铃,有两个球形的末端,中间被一个长而富有弹性的螺旋结构相连,每个末端有两个Ca2+结构域,每个结构域可以结合一Ca2+,这样,一个钙调蛋白可以结合4个Ca2+,钙调蛋白与Ca2+结合后的构型相当稳定。第14页，共25页，星期日，2025年，2月5日金属螯合色谱原理：利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为配基与二价金属离子发生螯合作用，结合在固定相上，二价金属离子可以与流动相中含有的半胱氨酸、组氨酸、咪唑及其类似物发生特异螯合作用而进行分离NH2NH2NiHisHisHisHisprotein第15页，共25页，星期日，2025年，2月5日步骤1.制作金属螯合亲和色谱柱：用浓度为0.2mol/L的CaCl2溶液上柱。将上清液PH调制6-8，加入蛋白质解离抑制剂。慢上样3.再用配体CaCl2溶液洗脱，下方流出为目的蛋白液，用大使管或者烧杯盛装之。2.上柱后依次用50mlbufferB、200ml含0.5mol/LNaCl的bufferB洗脱。下方用大试管或烧杯收集杂质液。第16页，共25页，星期日，2025年，2月5日配体蛋白质蛋白质和配体复合物第17页，共25页，星期日，2025年，2月5日步骤目的：除去蛋白液中配体离子方法一：半透膜进行透析方法二：将上次获得目的蛋白液经凝胶过滤色谱柱下方首次接受的溶液即为高纯度的钙调蛋白溶液；第二次接受到的即为配体离子的溶液。第18页，共25页，星期日，2025年，2月5日凝胶过滤色谱的洗脱第19页，共25页，星期日，2025年，2月5日定