蛋白质分离技术全.ppt

(3)进样装置流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：第95页，共146页，星期日，2025年，2月5日(4)高效分离柱柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，柱长5～40cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。第96页，共146页，星期日，2025年，2月5日(5)高效液相色谱检测器紫外光度检测器（UV）：最小检测量10-9g·mL-1，对流量和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱。最常用的检测器。第97页，共146页，星期日，2025年，2月5日光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。第98页，共146页，星期日，2025年，2月5日3.影响分离的因素影响分离的主要因素有:固定相及分离柱；流动相的流量、性质和极性;第99页，共146页，星期日，2025年，2月5日1）固定相及分离柱选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效，但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。选择短柱、细内径提高分析速度；研制高效柱填料是一活跃领域。第100页，共146页，星期日，2025年，2月5日2）流动相及流动相的极性（1）可显著改变组分分离状况的流动相选择在液相色谱中显得特别重要。液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。第101页，共146页，星期日，2025年，2月5日流动相组成流动相按组成不同可分为单组分和多组分；按极性可分为极性、弱极性、非极性；按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂:己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。第102页，共146页，星期日，2025年，2月5日4.高效液相色谱法的主要分离类型1）吸附色谱（液-固吸附色谱）以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。2）分配色谱（液-液分配色谱）早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相,现多为化学键合固定相，即用化学反应的方法通过化学键将固定液结合在担体表面。第103页，共146页，星期日，2025年，2月5日5.凝胶过滤在试验室中的应用1）生物大分子物质的分离纯化2）分子量的测定3）分级分离4）溶液浓缩5）平衡常数的测定6）细胞及颗粒的分离第63页，共146页，星期日，2025年，2月5日6.分子量的测定蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关:LogM=k1-k2Ve（Ve为洗脱体积）先测得几种标准蛋白质的Ve，并以其分子量对数对Ve作图得一直线，再测出待测样品的Ve，查标准曲线即可确定分子量。LogMABCLogM测V测第64页，共146页，星期日，2025年，2月5日（三）离子交换层析根据离子交换树脂对需要分离的各种离子的亲和力不同而达到分离的目的。离子交换树脂通常是不溶于水的高分子物质，分子中含有可解离的基团。含有酸性可解离基团的称为阳离子交换树脂，可解离出H+；含有碱性可解离基团的称为阴离子交换树脂，可解离出OH-。第65页，共146页，星期日，2025年，2月5日1.离子交换层析的原理生物大分子如蛋白质、核酸等多价电解质有不同的分子大小及电荷排列方式。当在一定pH下净电荷为负的蛋白质分子可通过静电键结合到带正电荷的阴离子交换剂上；当在一定pH下净电荷为正的蛋白质分子可通过静电键结合到带负电荷的阳离子交换剂上；大分子依其与离子交换剂亲和力的不同，而在以不同牢度被吸附于离子交换剂，通过改变离子强度或(和)pH使大分子再从离子交换剂上先后被洗脱下来。第66页，共146页，星期日，2025年，2月5日第67页，共146页，星期日，2025年，2月5日2.离子交换层析的应用1)水处理离子交换层析是一种简单而有效的杂质及各种离子的方法，聚丙乙烯树脂广泛的应用于高纯水的制备、硬水软化以及污水处