蛋白质检测方法.ppt

关于蛋白质检测方法第1页，共41页，星期日，2025年，2月5日Contents1、蛋白质简介2、蛋白质的检测方法3、蛋白质与疾病的关系第2页，共41页，星期日，2025年，2月5日蛋白质简介蛋白质是由氨基酸脱水缩合形成的空间结构复杂的大分子有机物，其主要化学元素为C（约50%）、O（约23%）、N（约16%）、H（约7%）、S（约0~3%）。氨基酸是蛋白质的基本组成单位，蛋白质既具有氨基酸的部分理化特性，也具有其它有机物的一些共性以及众多的自身独有特点与性质：高分子、两性解离及等电点、水合作用、变性作用、显色反应（双缩脲反应、Folin-酚反应、茚三酮反应、米伦反应、黄蛋白反应、乙醛酸反应、坂口反应、偶氮反应、考马斯亮蓝反应、氨基酸的α-氨基及α-羧基反应、）蛋白质的异常表达与体内多种疾病的发生发展息息相关第3页，共41页，星期日，2025年，2月5日蛋白质的检测方法传统蛋白质检测方法：免疫印迹法；酶联免疫吸附试验常规方法：物理法：紫外吸收法化学法：凯氏定氮法；比色法高效液相色谱法毛细管凝胶电泳法近红外光谱法质谱法荧光法第4页，共41页，星期日，2025年，2月5日免疫印迹法（Westernblot）原理：蛋白样品经过电泳分离后，转移并固定于膜上，然后应用抗原抗体反应进行特异性检测的方法。Western杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定相结合的特异性蛋白质的检测方法免疫印迹法是检测蛋白质混合溶液中某种特定目的蛋白的定性方法，也可以作为确定同一种蛋白质在不同细胞或同一种细胞在不同条件下的相对含量的半定量方法。第5页，共41页，星期日，2025年，2月5日免疫印迹法检测样品中特异蛋白质的基本流程样品的凝胶电泳蛋白印迹封闭反应与特异性抗体（一抗）孵育与酶耦联的二抗孵育显色或化学发光显影观察和记录结果第6页，共41页，星期日，2025年，2月5日酶联免疫吸附试验原理：酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbantassay，ELISA）是一种固相免疫测定技术，先将已知的抗原或抗体包被到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。测定时，将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗原或抗体发生特异性反应。最后加入酶反应底物，根据底物被酶催化产生的颜色及其光密度（OD）值的大小进行定性或定量分析。优点：灵敏度高；特异性好；简便；重复性好。ELISA和Western杂交都利用抗原抗体间的分子识别作用，借助不同的抗体分子标记实现蛋白质的检测。第7页，共41页，星期日，2025年，2月5日紫外吸收法理论基础：蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基使其在280nm处具有紫外吸收，其吸光度与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的吸光度值与肽键含量成正比。利用一定波长下蛋白质溶液的吸光度值与蛋白质浓度的正比关系可以测定蛋白质含量。优点：简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后能回收缺点:准确度较差、专一性差、干扰物质多，若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰第8页，共41页，星期日，2025年，2月5日凯氏定氮法理论基础：各种蛋白质的含氮量很接近，通常占其总重量的16％左右。蛋白质样品用浓硫酸消化后，可以转变为硫酸铵，硫酸铵中的NH4+与NaOH反应又可转变为NH3，用硼酸液吸收后，可由标准盐酸滴定并定量。凯氏定氮法由于蛋白质是体内的主要含氮物，因此，通过测定生物样品的含氮量便可估算出样品中的总蛋白质含量。蛋白质含量＝含氮量Х6.25此方法的测定范围为0.2～1.0mg氮。优点：应用范围广，重现性好、准确度高缺点：局限于样品中总蛋白的检测，破坏蛋白质结构，易受到被测样品中其它有机含氮化合物的干扰第9页，共41页，星期日，2025年，2月5日比色法-双缩脲法原理：蛋白质含有两个以上的肽键，故有双缩脲（NH2-CO-NH-CO-NH2）反应。在碱性条件下，肽键的质子被解离，Cu2+和失去质子的多肽链的氮相结合产生稳定的紫色络合物，在540～560nm的光吸收值与蛋白质的含量在一定范围内呈线性关系。由于与双缩脲试剂与不同种类的蛋白质反应产物的颜色差别极小，使得该方法比较适合总蛋白质的检测。优点：操作简单、测量速度快缺点：灵敏度较差，精度不高第10页，共41页，星期日，2025年，2月5日比色法-Folin-酚试剂/Lowry法原理：1、蛋白质在碱性条件下与试剂甲（双缩脲试剂）中的Cu2+形成