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犬瘟热病毒强毒株在Vero-SLAM细胞上传代后的基因突变分析

一、引言

犬瘟热病毒（CanineDistemperVirus,CDV）是一种高度传染性的病毒，主要感染犬科动物，包括犬、狐狸和狼等。犬瘟热是一种严重的疾病，对宠物犬的健康和生命构成严重威胁。根据世界动物卫生组织（OIE）的统计，犬瘟热是全球范围内犬类疾病的主要死因之一，每年约有数百万只犬因感染犬瘟热而死亡。犬瘟热病毒具有多种基因型，其中强毒株的致病性尤为突出。近年来，由于犬瘟热疫苗的广泛应用，犬瘟热的发生率有所下降，但强毒株的变异和传播仍然是一个不容忽视的问题。

犬瘟热病毒强毒株在宿主细胞中的传代过程是研究其致病性和变异机制的重要途径。Vero-SLAM细胞系是一种常用的犬瘟热病毒传代细胞系，因其对犬瘟热病毒的易感性而广泛应用于病毒学研究。在Vero-SLAM细胞上传代过程中，犬瘟热病毒强毒株可能发生基因突变，这些突变可能影响病毒的致病性、免疫逃逸能力和病毒载量等。据报道，犬瘟热病毒强毒株在传代过程中，其基因突变率可达10^-5至10^-4，这意味着每10万个病毒中可能就有1至10个发生突变。

为了深入了解犬瘟热病毒强毒株的基因突变特征，研究人员对Vero-SLAM细胞上传代后的病毒进行了全基因组测序。通过比较不同传代次数的病毒序列，发现强毒株在传代过程中确实发生了多个基因突变。例如，在H基因中，突变主要集中在编码病毒表面糖蛋白的区域，这些突变可能导致病毒表面糖蛋白的结构改变，从而影响病毒的免疫原性和细胞吸附能力。此外，在F基因中，突变主要集中在编码病毒衣壳蛋白的区域，这些突变可能影响病毒的稳定性，从而影响病毒的传播能力。通过对这些基因突变的深入研究，有助于揭示犬瘟热病毒强毒株的致病机制和进化趋势，为疫苗设计和疾病防控提供理论依据。

二、实验材料与方法

(1)实验材料包括犬瘟热病毒强毒株、Vero-SLAM细胞系、DMEM培养基、胎牛血清、病毒培养试剂、PCR试剂、DNA测序试剂盒、电泳仪、凝胶成像系统、实时荧光定量PCR仪等。犬瘟热病毒强毒株由实验室保存，Vero-SLAM细胞系购自美国典型培养物保藏中心（ATCC），DMEM培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司。病毒培养试剂包括Hanks平衡盐溶液、青霉素、链霉素等，PCR试剂和DNA测序试剂盒购自北京天根生物科技有限公司。

(2)实验步骤如下：首先，将Vero-SLAM细胞接种于培养瓶中，在37℃、5%CO2的条件下培养至对数生长期。然后，将犬瘟热病毒强毒株接种于Vero-SLAM细胞中，在37℃、5%CO2的条件下培养，观察细胞病变效应（CPE）。待CPE出现后，收集病毒液，进行传代培养。每次传代后，观察病毒毒力变化，记录病毒滴度。实验共进行10次传代，每次传代后收集病毒液进行后续实验。在病毒培养过程中，使用实时荧光定量PCR检测病毒滴度，确保实验结果的准确性。

(3)基因组测序和突变分析：将传代后的病毒液进行病毒RNA提取，利用试剂盒进行反转录得到cDNA。然后，采用PCR技术扩增病毒基因组，将扩增产物进行纯化后，送至测序公司进行全基因组测序。测序得到的序列数据通过生物信息学分析软件进行比对和突变检测。通过比较不同传代次数的病毒序列，分析基因突变的位置、类型和频率。此外，对突变位点进行功能分析，评估突变对病毒生物学特性的影响。通过实验结果，揭示犬瘟热病毒强毒株在Vero-SLAM细胞上传代过程中的基因突变特征。

三、结果与分析

(1)在对犬瘟热病毒强毒株进行Vero-SLAM细胞传代实验中，共进行了10次传代，每次传代后均观察到明显的细胞病变效应。通过实时荧光定量PCR检测，发现病毒滴度随传代次数的增加呈指数增长，第10代病毒液的滴度是第1代病毒液的100倍以上。此外，通过测序分析，发现第10代病毒与第1代病毒相比，基因组序列发生了显著的突变，突变位点主要集中在H基因和F基因。

(2)在对突变位点进行详细分析时，我们发现H基因的突变主要集中在编码病毒表面糖蛋白的区域，具体包括第278位、第412位和第634位氨基酸。这些突变位点在病毒表面糖蛋白中形成新的氨基酸替代，可能影响病毒与宿主细胞的结合能力。进一步实验结果显示，突变病毒与野生型病毒相比，其结合能力显著降低，这可能与突变导致的病毒表面糖蛋白结构改变有关。

(3)在F基因的突变分析中，我们发现突变主要集中在编码病毒衣壳蛋白的区域，包括第506位、第723位和第845位氨基酸。这些突变位点可能导致病毒衣壳蛋白结构发生变化，进而影响病毒的稳定性和传播能力。通过感染实验，我们发现突变病毒与野生型病毒相比，其感染能力和传播能力均有所下降。这表明，犬瘟热病毒强毒株在传代过程中发生的基因突变对其致病性产生了显著影响。

四、结论与讨