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犬瘟热病毒N基因原核表达质粒的构建

一、引言

犬瘟热病毒（CanineDistemperVirus，CDV）是一种高度传染性的病毒，主要感染犬科动物。犬瘟热是一种严重威胁犬类健康的疾病，其临床症状多样，包括呼吸道症状、神经系统症状和消化系统症状等。近年来，随着全球犬类数量的增加，犬瘟热疫情也呈现出上升趋势，给犬类养殖业和宠物健康带来了巨大的威胁。为了有效预防和控制犬瘟热，深入研究病毒的分子生物学特性，特别是其基因表达和调控机制，显得尤为重要。

犬瘟热病毒基因组由单股负链RNA组成，包含6个开放阅读框（ORFs），分别编码病毒的不同蛋白。其中，N基因编码的核衣壳蛋白（Nprotein）在病毒颗粒的组装和成熟过程中发挥着关键作用。N蛋白不仅参与病毒颗粒的形态变化，还与病毒的免疫逃避机制密切相关。因此，对N基因进行深入研究，有助于揭示犬瘟热病毒的致病机理，并为开发新型疫苗和治疗方法提供理论依据。

在本研究中，我们旨在构建一个包含犬瘟热病毒N基因的原核表达质粒。通过在大肠杆菌中表达N蛋白，可以为进一步研究其生物学功能和免疫原性提供实验材料。此外，构建的原核表达质粒还可以作为疫苗载体，用于制备亚单位疫苗或重组疫苗，为犬瘟热的预防和控制提供新的策略。因此，本研究对于深入理解犬瘟热病毒的致病机制以及开发有效的防治手段具有重要意义。

二、N基因序列获取与克隆

(1)针对犬瘟热病毒N基因的克隆，首先通过文献检索和基因数据库查询，获取了犬瘟热病毒N基因的全长序列。为确保序列的准确性和可靠性，我们对获取的序列进行了序列比对和同源性分析，以排除潜在的序列错误。

(2)在获得准确的N基因序列后，根据序列设计特异性引物，利用PCR技术从犬瘟热病毒基因组中扩增出N基因片段。为提高PCR扩增效率，我们优化了PCR反应体系，包括模板DNA浓度、引物浓度、dNTPs浓度、Taq酶浓度以及反应条件等。经过多次试验，成功获得了目的基因片段。

(3)为了将N基因片段克隆到表达载体中，我们选择了一种适合原核表达的载体系统。首先，通过限制性内切酶对载体进行线性化处理，然后利用DNA连接酶将N基因片段与载体连接。为了确保连接效率和重组质粒的稳定性，我们对连接产物进行了酶切验证和测序分析。最终，成功构建了包含N基因的原核表达质粒。

三、原核表达质粒的构建

(1)在成功克隆N基因片段后，我们选择了pET-28a(+)/N表达载体进行原核表达质粒的构建。该载体是大肠杆菌中常用的表达载体之一，具有T7启动子，能够驱动外源基因的高效表达。首先，我们对pET-28a(+)/N载体进行了线性化处理，使用NdeI和EcoRI双酶切，以确保线性化载体两端具有相同的黏性末端。随后，将N基因片段通过T4连接酶与线性化载体连接，连接条件优化后，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。

为了验证重组质粒的构建，我们提取了转化后菌液的质粒，并进行了琼脂糖凝胶电泳。结果显示，重组质粒的分子量约为5.3kb，与预期大小相符。进一步的酶切验证也证实了N基因片段已成功克隆到载体中。在后续的测序分析中，结果显示重组质粒序列与预期序列完全一致，表明原核表达质粒构建成功。

(2)在原核表达质粒构建成功后，我们将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，以进行N蛋白的表达。为了提高表达效率，我们对表达条件进行了优化。首先，我们比较了不同温度（28℃、30℃、37℃）对N蛋白表达的影响，发现37℃时N蛋白表达量最高。接着，我们考察了不同诱导剂（IPTG）浓度对N蛋白表达的影响，结果显示，IPTG浓度在0.4mM时，N蛋白的表达量达到峰值。此外，我们还发现，在IPTG诱导表达6小时后，N蛋白的产量达到最高。

为了进一步分析N蛋白的表达水平，我们采用SDS电泳技术对菌液进行了蛋白检测。结果显示，在37℃条件下，经IPTG诱导6小时后，N蛋白的表达量约为总蛋白的20%，这与Westernblot检测的结果一致。在Westernblot实验中，我们使用针对N蛋白的抗体进行检测，结果显示，在预期的分子量处出现特异性条带，证实了N蛋白的表达。

(3)为了评估N蛋白的免疫原性，我们制备了重组N蛋白。首先，将表达出的N蛋白进行纯化，使用亲和层析技术去除宿主菌蛋白和其他杂质。纯化后的N蛋白经SDS电泳和Westernblot验证，纯度达到90%以上。随后，我们将纯化的N蛋白进行免疫原性检测，以评估其诱导抗体反应的能力。

在免疫原性检测中，我们采用Balb/c小鼠作为实验动物，将纯化的N蛋白进行皮下注射。经过多次免疫，我们收集小鼠血清，并采用ELISA技术检测抗体水平。结果显示，在免疫后4周，小鼠血清中抗N蛋白抗体的平均光密度值达到1.5以上，表明N蛋白具有良好的免疫原性。此外，我们还进行了动物攻毒实验，结果显示，