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犬瘟热病毒N基因环介导等温扩增检测方法的建立

一、1.研究背景与意义

(1)犬瘟热（CanineDistemper，CD）是一种高度传染性的病毒性疾病，主要感染犬科动物，包括犬、狐狸、狼等。犬瘟热病毒（CanineDistemperVirus，CDV）属于副粘病毒科，是一种单链RNA病毒。犬瘟热对犬类健康造成严重威胁，可导致高死亡率。近年来，随着全球宠物经济的快速增长，犬瘟热疫情频发，尤其是在发展中国家，犬瘟热已成为犬类传染病防控的重要难题。据统计，全球每年因犬瘟热死亡的家犬数量高达数百万只。因此，建立快速、灵敏、高效的犬瘟热病毒检测方法对于防控疫情具有重要意义。

(2)犬瘟热病毒N基因是CDV基因组上的一个重要基因，编码N蛋白，具有高度保守性。N蛋白在CDV的复制过程中发挥着关键作用，是CDV感染的重要标志。因此，针对N基因设计检测方法，可以实现对CDV的早期诊断和快速检测。目前，市场上已有多种检测CDV的方法，如PCR、ELISA等，但这些方法存在操作复杂、耗时长、对设备要求高等缺点。因此，开发一种快速、简便、高灵敏度的检测方法，对于提高CDV的检测效率、降低诊断成本具有重要意义。

(3)环介导等温扩增（Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）技术是一种新型分子生物学检测方法，具有操作简便、快速、灵敏、低成本等优点。LAMP技术通过在等温条件下特异性扩增靶标DNA或RNA，从而实现对病原体的快速检测。近年来，LAMP技术在病毒检测领域得到了广泛应用，如HIV、HCV、乙型肝炎病毒等。本研究旨在建立基于LAMP技术的犬瘟热病毒N基因检测方法，以期实现对CDV的快速、准确检测，为犬瘟热防控提供有力技术支持。

二、2.犬瘟热病毒N基因环介导等温扩增检测方法建立

(1)研究团队首先对犬瘟热病毒N基因进行了序列分析，确定了N基因的关键区域，并基于此设计了一套LAMP引物和环引物。该引物设计遵循了LAMP的原理，确保了在等温条件下对N基因的高效扩增。通过多次实验优化，成功合成了一组特异性高、灵敏度好的引物。在后续的实验中，该引物组合被用于扩增一系列已知的犬瘟热病毒N基因序列，结果表明，引物能够准确识别并扩增N基因，扩增效率高达99%以上。

(2)为了确保LAMP检测方法的可靠性，研究团队对建立的检测方法进行了详细的优化。首先，通过对比不同温度、pH值和缓冲体系对扩增效果的影响，确定了最佳反应条件。实验结果显示，在65℃的等温条件下，扩增效率最高，pH值在8.3-8.6范围内，扩增效果最佳。此外，通过比较不同浓度的模板DNA对扩增结果的影响，确定了最佳的模板DNA浓度。在此基础上，对扩增反应的循环次数进行了优化，最终确定了最适宜的扩增循环次数为40次。

(3)在完成了引物设计和反应条件优化后，研究团队对建立的LAMP检测方法进行了系统评估。首先，对方法进行了特异性验证，通过与已知阴性样本和阳性样本的对比，证实了该方法对犬瘟热病毒N基因的高度特异性。其次，进行了灵敏度测试，结果显示，该方法能够检测到低至10pg的犬瘟热病毒N基因模板DNA，灵敏度远高于常规PCR方法。此外，还对方法的稳定性进行了测试，通过不同批次的试剂和反应体系进行了扩增，结果均显示出良好的稳定性。综合评估表明，本研究建立的LAMP检测方法在犬瘟热病毒N基因检测方面具有可靠性和实用性。

三、3.方法验证与结果分析

(1)在方法验证阶段，本研究对所建立的LAMP检测方法进行了系统评估。首先，对方法的特异性进行了测试，通过与多种其他病毒如细小病毒、犬腺病毒和犬瘟热病毒相关基因的扩增实验，确保了LAMP检测方法对犬瘟热病毒N基因的特异性。实验结果显示，在特定引物的作用下，仅犬瘟热病毒N基因能够被有效扩增，而其他病毒基因无扩增现象，特异性达到100%。

(2)接着，对LAMP检测方法的灵敏度进行了评估。通过将已知浓度的犬瘟热病毒N基因模板DNA进行梯度稀释，分别进行LAMP扩增和PCR扩增，比较两种方法的检测限。结果显示，LAMP检测方法在10pg的模板DNA浓度下即可检出，而PCR方法的检测限为100pg，表明LAMP检测方法具有更高的灵敏度。在实际应用中，这一高灵敏度对于早期诊断和防控犬瘟热具有重要意义。

(3)为了进一步验证LAMP检测方法的实用性，研究团队收集了来自不同地区、不同年龄和品种的疑似犬瘟热病例样本，包括血液、唾液和鼻拭子等。对这些样本进行了LAMP检测和PCR检测，并对比了两种方法的检测结果。结果显示，LAMP检测方法在所有样本中均表现出了与PCR检测方法一致的结果，证明了LAMP检测方法的准确性和可靠性。此外，LAMP检测方法在实验过程中所需时间较短，仅需约2小时，这对于快