蛋白质的提取.ppt

V=EQ/(6πrη)M=V/E=Q/(6πrη)V：电泳速度M：迁移率E：电场强度Q：颗粒带电荷量r：球形分子半径η：介质粘度第31页，共72页，星期日，2025年，2月5日【实验原理】

2.影响电泳的因素：内在因素：蛋白所带净电荷的量、蛋白的大小和形状外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象第32页，共72页，星期日，2025年，2月5日影响蛋白质分子运动速度的因素?决定运动方向电场作用力形成阻力决定运动速率电荷性质电荷量分子形状分子大小√√√√√√√第33页，共72页，星期日，2025年，2月5日3.醋酸纤维素溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为120μm，有很强的通透性，对分子移动阻力很小。该薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优点第34页，共72页，星期日，2025年，2月5日血清蛋白参考值等电点分子量（kDa）占总蛋白的百分数(%)清蛋白4.646961~71α1球蛋白5.062003~4α2球蛋白5.063006~10β球蛋白5.1290~1507~11γ球蛋白6.85156~9509~18第35页，共72页，星期日，2025年，2月5日4.经醋酸纤维素薄膜电泳可将血清蛋白按电泳速度分为5条区带，从正极端依次为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白，经染色可计算出各蛋白质的百分含量。第36页，共72页，星期日，2025年，2月5日【实验器材】1.DYY-6C型?双稳定时电泳仪和DYY-Ⅲ型电泳槽2.醋酸纤维薄膜（2cm×8cm）：1片/人。3.培养皿：一排桌子公用5套，包括平衡、染色各用一套，漂洗用3套。4.点样器：载玻片。5.滤纸：公用。6.镊子：一个/组。第37页，共72页，星期日，2025年，2月5日【实验试剂】1、巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH8.6，0.07mol/L，离子强度0.06)2、0.5%氨基黑10B染色液3、漂洗液第38页，共72页，星期日，2025年，2月5日1.浸泡将2×8cm醋酸纤维薄膜置于电泳缓冲液中，浸泡15min左右，至完全浸透，方可用于点样。【实验操作】第39页，共72页，星期日，2025年，2月5日2.点样用镊子取出浸透的薄膜，夹在两层粗滤纸内吸干多余的缓冲液，迎光判断光面与无光泽面。用边缘整齐的玻片沾取少量无溶血血清，垂直按压于醋纤膜标号一端约1.5-2㎝处(约2～3μl)第40页，共72页，星期日，2025年，2月5日3.电泳将点样端的薄膜平贴在阴极滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极滤纸桥上(见下图)。要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。平衡片刻(2-3min)；使其自然充满缓冲液；而后电压120V，电流0.4～0.6mA/㎝，通电45分钟。第41页，共72页，星期日，2025年，2月5日4.染色：电泳完毕后将薄膜取下,放在含氨基黑10B染色液的培养皿中浸泡3-5min第42页，共72页，星期日，2025年，2月5日5.漂洗：将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗数次(3-4次)，直至条带清晰为止，可得到色带清晰的电泳图谱。第43页，共72页，星期日，2025年，2月5日6.记录和分析实验结果

漂洗完毕后将薄膜取出,放在滤纸上。将薄膜上的5条色带根据其颜色深浅、形状、大小及相对位置进行描述、记录在预习本上，并判断分析其结果。第44页，共72页，星期日，2025年，2月5日【注意事项】1、点样前，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，吸水量以不干不湿为宜。2、薄膜的浸润与选择正确膜面是电泳成败的关键之一。3、点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，不宜过多或过少。4.手尽量不要触及薄膜，用镊子夹取。5、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。垂直点样。6、电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且点样面向下。7、电泳开始后，不能再取放薄膜，以防触电。如必需进行，要先关闭电源。8、应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太短，着色不易区分，或造成条带染色不均匀，必要时可进行复染。第45页，共72页，星期日，2025年，2月5日【思考题】电泳