酶学反应技术之酶偶联技术讲解.pptx

酶学反应技术之酶偶联技术

掌握：酶偶联测定法，偶联的原理。

教学目标

熟悉：工具酶的概念。

一、工具酶

定义：

偶联：工具酶与待测酶、工具酶与工具酶之间的联合

工具酶：将作为试剂用于测定待测酶活性或底物浓度的酶

工具酶有氧化还原酶类、转移酶类和水解酶类

分类：

常用工具酶的名称及其缩写符号

名称缩写符号名称缩写符号

乳酸脱氢酶LDH

苹果酸脱氢酶MDH

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶G-6-PD

谷氨酸脱氢酶GLDH

葡萄糖氧化酶GOD

胆固醇氧化酶COD

磷酸甘油氧化酶GPO

过氧化物酶POD

己糖激酶HK

肌酸激酶CK

丙酮酸激酶PK

甘油激酶GK

脂蛋白脂肪酶LPL

胆固醇酯酶CE

脲酶Ure

肌酐酶Cr

二、单酶反应和酶偶联反应技术

与酶活性测定方法类似

（一）单酶反应

技术简单，反应通式如下：

AB

E

可监测产物

待测物质

工具酶

（二）酶偶联测定法

应用：对于底物或产物不能直接测定或难于准确测定的酶促反应,可用于测定酶活性或底物测定

ExEaEi

ABCP

待测物质

中间产物

终产物

指示酶

辅助酶

待测酶

酶偶联反应的原理：

在应用酶偶联法测定时，关键在于确定恒态期，因为只有恒态期才能代表酶活性。如酶促反应底物动力学所述，恒态期可以通过测定指示酶的Km和Vmax等动力学因数加以计算确定

常用指示酶及其指示反应

1.脱氢酶

用作工具酶的脱氢酶都是以NAD(P)H为辅酶的脱氢酶，例如LDH、MDH、G-6-PD、GLDH等，它们催化下列反应：

P+NAD(P)H+H+PH2+NAD(P)+

可对NAD(P)H在紫外吸收或紫外激发荧光进行测定

应用：ALT、AST、CK等酶活性测定

2.过氧化物酶（POD）

POD可催化过氧化氢与某些色原反应，例如与4-氨基安替比林（4-AAP）和酚反应，将其氧化为有色物质，反应如下：

POD

2H2O2+4-AAP+酚醌亚胺（红色）+2H2O

Trinder反应：

应用：GOD、COD、GPO、甘油氧化酶、尿酸酶（属于氧化酶类）等都可以将各自的底物氧化为过氧化氢，因此都可以与POD偶联，通过Trinder反应加以测定

色原物质

酶偶联法测定ALT的吸光度变化图

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第一试剂与样本混合

第二试剂与样本混合

预孵育期

延滞期

线性期

非线性期

反应进程曲线（速率法）

时间（s）317334351368385402419

吸光度（A）1.2531.2041.1781.1461.1261.0971.048

据此计算此酶的∆A/min

速率法

终点法

小结

方法

原理

【酶学反应技术之偶联技术】

谢谢大家！