蛋白质样品的制备.ppt

⑸甲苯磺酰赖氨酸甲酮（TLCK），甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮（TPCK）通常浓度在0.1-0.15mmol/L，这些相同的成分不可逆抑制许多丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。⑹Benzamidine通常浓度为1-2mmol/L，抑制丝氨酸蛋白酶。⑺变性剂在低温条件下处理。①直接加入强变性剂8mol/L脲、10％TCA或2％SDS。②强碱下抑制酶活，许多组织蛋白酶在pH超过9.0的时候失活。第23页，共56页，星期日，2025年，2月5日四、分离和提取蛋白质（蛋白质沉淀步骤）这是一种可选择的方法。通常用于选择性清除杂质，如盐离子、核酸、脂类等会干扰二维电泳结果。重悬之后的沉淀蛋白也可用来制备浓度稀释的样品。沉淀并不是完全有效的，某些蛋白在沉淀后并不容易重悬。因此在样品的制备过程中，应用沉淀的步骤可能会改变蛋白的二维电泳图谱。第24页，共56页，星期日，2025年，2月5日⑴硫酸铵沉淀（盐析）原理：在高盐溶液中，蛋白倾向于聚合，并从溶液中沉淀下来。许多潜在的杂质（如核酸）将保持在溶液中。步骤：蛋白浓度大于lmg/ml，缓冲液浓度大于50mmol/L,并含有EDTA,缓慢加入硫酸铵至饱和，搅拌10-30min，通过离心沉淀蛋白。然而许多蛋白在高盐溶液中是可溶的，因此，这种方法只能被用来预分离或富集蛋白。并且，残存的硫酸铵会干扰IEF,必须被清除。第25页，共56页，星期日，2025年，2月5日⑵TCA沉淀（三氯醋酸沉淀）这是一种有效的蛋白沉淀方法，将TCA加到提取液中，终浓度将高达10％-20％。蛋白质可于冰上沉淀30min。另外，组织样品可以直接用10％-20％的TCA进行匀浆。这种方法可限制蛋白降解和其它的化学修饰。最后用丙酮或乙醇清洗沉淀，以除去TCA。然而，蛋白质再溶解是很困难的，并且不能完全再溶。残留的TCA必须通过乙醇或丙酮彻底清除，若过多暴露与低PH溶液中可能导致某些蛋白降解或修饰。第26页，共56页，星期日，2025年，2月5日⑶丙酮沉淀这种有机溶剂通常用来沉淀蛋白，以清除许多杂质，如去污剂、脂类。于提取物中加入至少3倍体积的冰丙酮，使蛋白在-20℃沉淀至少2h，再离心沉淀蛋白。残留的丙酮通过空气干燥或冻干除去。第27页，共56页，星期日，2025年，2月5日⑷在丙酮中用TCA沉淀两者联合应用更加有效，通常用10％TCA在丙酮中重悬裂解的样品溶液（含有0.01％β-巯基乙醇溶液或20mmol/LDTT）。至少在-20℃沉淀45min，通过离心沉淀蛋白，并用含0.01％β-巯基乙醇溶液或20mmol/LDTT的冰丙酮清洗沉淀。通过空气干燥或冻干去除残留的丙酮。此方法仍然存在难再溶的现象。第28页，共56页，星期日，2025年，2月5日⑸用苯酚提取，随后在甲醇中用醋酸铵沉淀这对于杂质含量高的植物样品很有效。蛋白质被提取到饱和酚中，然后在甲醇中用醋酸铵从酚相中沉淀蛋白。这些沉淀在甲醇中用醋酸铵洗涤几次，然后用丙酮清洗，残留的丙酮通过蒸发除去。但是这种方法比较复杂，并且耗时较多。第29页，共56页，星期日，2025年，2月5日在蛋白质样品制备中，蛋白质裂解是指对样品蛋白质进行增溶性溶解的过程，其目的是破坏蛋白质与蛋白质分子、蛋白质与非蛋白质之间的共价与非共价相互作用；使蛋白质变性及还原；去除非蛋白质组分，如核酸、脂类等。为了达到这一目的，在蛋白质样品制备过程中需使用表面活性剂、还原剂及离液剂。第三节蛋白质裂解技术第30页，共56页，星期日，2025年，2月5日一、裂解液

在蛋白质组学研究中，蛋白质裂解是一个重要的环节。蛋白质间的分开与疏远程度关系到双向电泳的分离效果。选择适宜的裂解剂能够实现蛋白质间的良好分离，是提高双向电泳分离效果的一个有力措施。⑴离液剂尿素是常用的离液剂，它的主要作用是改变或破坏氢键等次级键的结构，使得蛋白变性并使蛋白酶失活。尿素作为一种中性的离液剂，通常在裂解液中的浓度为8mol/L。尿素可溶解和解折叠大多数的蛋白质，形成完全随机的构象，使所有的离子基团暴露于溶液中。近来硫脲的加入可以进一步提高溶解度，特别是膜蛋白。在实际应用中，需要高溶解强度时，一般用2mol/L硫脲和5-8mol/L的尿素联合使用。第31页，共56页，星期日，2025年，2月5日⑵还原剂还原剂主要是用来断裂蛋白分子中Cys残基之间形成的二硫键，增加蛋白的溶解性。通常用的