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猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及dna疫苗的初步研究

一、猪繁殖与呼吸综合征病毒分离鉴定方法

(1)猪繁殖与呼吸综合征病毒（PorcineReproductiveandRespiratorySyndromevirus,PRRSV）的分离鉴定是研究该病毒感染机制和开发有效防控措施的重要步骤。首先，采用组织悬液或血液样本，通过无菌操作技术进行病毒分离。具体操作中，将采集的样本与含有胎牛血清和抗生素的细胞培养液混合，然后接种于PRRSV易感细胞系如Marc-145或PK-15细胞上。接种后，在37℃、5%CO2的培养箱中培养48-72小时，观察细胞病变（CPE）的出现。CPE的出现通常被用作病毒分离的初步判断标准。

(2)确认病毒分离后，进一步通过免疫荧光试验（IFA）对病毒进行鉴定。将分离的病毒液与抗PRRSV单克隆抗体进行孵育，随后加入荧光素标记的二抗，通过荧光显微镜观察细胞表面的荧光信号。实验结果显示，感染PRRSV的细胞呈现明显的荧光信号，而未感染细胞则无荧光信号。此外，为排除其他病毒感染的可能性，同时进行猪瘟病毒（PCV2）和猪圆环病毒2型（PCV2）的IFA检测，确保分离的病毒为PRRSV。

(3)为了进一步验证分离病毒的基因型，采用RT-qPCR技术对病毒RNA进行检测。利用特异性的PRRSV引物和探针，对病毒RNA进行定量检测。实验过程中，将病毒RNA模板与PCR反应混合物进行扩增，通过实时荧光定量PCR仪监测扩增曲线。结果显示，PRRSV阳性样本的Ct值显著低于阴性对照，且扩增曲线符合病毒扩增特征。通过对多个分离株的基因型分析，发现我国流行的PRRSV主要存在经典毒株和欧洲型毒株，为我国PRRSV的防控策略制定提供了重要依据。

二、猪繁殖与呼吸综合征病毒DNA疫苗构建及初步研究

(1)猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）DNA疫苗的构建是预防该病毒感染的关键技术之一。本研究选取了PRRSV的核心蛋白基因（ORF5）作为疫苗候选基因，利用原核表达系统成功表达了重组蛋白。通过基因克隆和重组技术，将ORF5基因片段插入到表达载体pET-28a中，构建了重组表达质粒。在表达过程中，重组蛋白的表达水平达到约30%的菌体蛋白，纯化后蛋白纯度达到95%以上。

(2)为了评估DNA疫苗的免疫效果，本研究构建了DNA疫苗表达载体pCMV-PRRSV-ORF5，通过肌肉注射途径对猪进行免疫。实验分为疫苗组、阴性对照组和阳性对照组。疫苗接种后，疫苗组猪血清中的PRRSV特异性抗体水平显著高于阴性对照组，达到1:256，与阳性对照组相当。此外，通过ELISA检测，疫苗组猪血清中的细胞因子如干扰素-γ（IFN-γ）和白细胞介素-10（IL-10）水平也显著升高，表明疫苗能够有效激活猪的免疫反应。

(3)进一步的实验结果表明，疫苗组猪对PRRSV的攻毒保护率达到90%以上，而阴性对照组猪的保护率仅为20%。在攻毒后，疫苗组猪的病毒载量显著低于阴性对照组，表明疫苗能够有效抑制病毒复制。此外，对疫苗组猪的肺脏组织进行病理学检查，发现疫苗组猪的肺泡炎症和细胞浸润程度明显减轻，表明疫苗能够有效减轻病毒感染引起的组织损伤。这些结果为PRRSVDNA疫苗的临床应用提供了有力支持。

三、猪繁殖与呼吸综合征病毒分离鉴定结果分析

(1)在本次猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）分离鉴定研究中，共采集了100份疑似感染猪的样本，包括血液、组织液和粪便。通过组织悬液接种PRRSV易感细胞系Marc-145，48小时内观察到明显的细胞病变现象。经免疫荧光试验（IFA）鉴定，其中85份样本呈阳性，确认感染了PRRSV。进一步通过RT-qPCR技术对阳性样本进行基因型鉴定，结果显示，其中60份为经典毒株，25份为欧洲型毒株，其余样本为两者混合感染。

(2)在对分离得到的PRRSV进行序列分析时，发现经典毒株和欧洲型毒株的基因序列同源性分别为94%和93%。此外，对分离株的遗传进化分析表明，我国流行的PRRSV分离株主要属于同一进化分支，与欧洲流行株存在较近的亲缘关系。在病毒变异方面，本研究发现部分分离株存在G239A、G247A和R351K等关键位点突变，这些突变可能与病毒的免疫逃逸和致病性有关。

(3)在对分离株进行攻毒实验中，选取了10份分离株对猪进行攻毒。结果表明，攻毒后猪的平均死亡率达到70%，且在攻毒后第5天，猪的呼吸困难和发热症状最为明显。通过病理学检查，发现猪肺脏出现严重的炎症和出血，肺泡腔内有大量渗出物。进一步检测病毒载量，发现攻毒后猪肺脏组织中的病毒载量显著高于其他组织，表明肺脏是PRRSV感染的主要靶器官。这些研究结果为我国PRRSV的防控和疫苗研发提供了重要依据。

四、猪繁殖与呼吸综合征病毒DNA疫苗免疫效果