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猪伪狂犬病毒HN-LD株分离鉴定及部分毒力基因遗传进化分析

一、引言

(1)猪伪狂犬病（PRV）是一种高度传染性的病毒性疾病，严重威胁着养猪业的健康发展。随着养殖密度的增加和生物安全措施的不足，猪伪狂犬病的流行范围不断扩大，给养猪业带来了巨大的经济损失。近年来，我国各地猪伪狂犬病疫情时有发生，给养殖业造成了极大的困扰。因此，对猪伪狂犬病毒进行深入研究，特别是在病原学、流行病学和分子生物学方面的研究，对于制定有效的防控措施具有重要意义。

(2)猪伪狂犬病毒HN-LD株是我国猪伪狂犬病流行的主要毒株之一，其具有较高的致病性和致死率。为了深入了解HN-LD株的致病机制和流行规律，本研究对HN-LD株进行了分离鉴定，并对部分毒力基因进行了遗传进化分析。通过对HN-LD株的分子特征进行深入研究，有助于揭示该毒株的致病机制，为猪伪狂犬病的防控提供科学依据。

(3)本研究通过病毒分离和鉴定技术，成功分离纯化了猪伪狂犬病毒HN-LD株，并通过分子生物学方法对毒力基因进行了克隆和测序。通过对毒力基因的遗传进化分析，可以了解HN-LD株的分子特征和进化趋势，为猪伪狂犬病的防控策略提供数据支持。此外，本研究还对HN-LD株的致病性和免疫保护效果进行了初步评估，为后续的疫苗研发和防控工作提供了参考。

二、材料与方法

(1)实验材料包括猪伪狂犬病疑似病料、健康猪血清、病毒分离与鉴定试剂、PCR扩增试剂盒、克隆载体、限制性内切酶、DNA连接酶、DNA标记物、质粒提取试剂盒、DNA纯化试剂盒、电泳试剂、凝胶成像系统等。猪伪狂犬病疑似病料来源于临床发病猪场，经临床症状和病理剖检确诊为猪伪狂犬病。健康猪血清购自无特定病原体（SPF）猪场。病毒分离与鉴定试剂、PCR扩增试剂盒、克隆载体、限制性内切酶、DNA连接酶、DNA标记物等均购自国内外知名生物试剂公司。

(2)病毒分离与鉴定：将疑似病料进行无菌操作，接种于猪肾细胞（PK-15）培养瓶中，37℃培养48小时。观察细胞病变，收集细胞培养液，进行病毒分离。采用RT-PCR技术对分离的病毒进行鉴定，检测病毒基因组的特异性。PCR扩增引物设计根据猪伪狂犬病毒基因组的保守序列，通过生物信息学软件进行设计。PCR反应体系包括病毒RNA模板、引物、逆转录酶、dNTPs、缓冲液等。PCR反应条件为：95℃预变性5分钟，35个循环（95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒），最后72℃延伸10分钟。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，目的条带长度与预期相符。

(3)毒力基因克隆与测序：根据猪伪狂犬病毒毒力基因的保守序列设计引物，对分离的病毒进行PCR扩增。PCR反应体系包括病毒基因组DNA模板、引物、DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液等。PCR反应条件同上。扩增产物经纯化后，连接至克隆载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。挑取阳性克隆，进行菌落PCR鉴定，选取阳性克隆进行测序。测序结果经生物信息学软件进行比对和分析，确定毒力基因的序列和结构特征。通过生物信息学软件进行遗传进化分析，构建毒力基因的系统发育树，分析毒力基因的进化关系。

三、猪伪狂犬病毒HN-LD株的分离与鉴定

(1)实验选取了来自我国多个猪场的疑似猪伪狂犬病病料，共收集到100份样本。通过细胞培养试验，将病料接种于猪肾细胞（PK-15）中，37℃培养48小时。结果显示，在50份样本中观察到明显的细胞病变现象，细胞出现圆形变、脱落等特征。通过RT-PCR检测，这些样本均呈阳性反应，表明猪伪狂犬病毒存在。

(2)针对RT-PCR检测阳性的50份样本，进一步进行了病毒分离纯化。将阳性样本接种于PK-15细胞，连续传代培养，直至获得稳定生长的细胞病变。通过病毒滴度测定，分离得到的病毒滴度在10^7.5-10^8.0TCID50/mL之间。将分离得到的病毒再次进行RT-PCR检测，结果显示，所有病毒株均呈现猪伪狂犬病毒特异性基因片段，进一步证实了病毒分离的成功。

(3)为鉴定分离得到的病毒株，对其进行了基因型鉴定。通过PCR扩增猪伪狂犬病毒基因组的保守区域，将扩增产物进行测序，并与已知猪伪狂犬病毒基因序列进行比对。结果显示，分离得到的病毒株与我国流行的猪伪狂犬病毒HN-LD株高度同源，同源性达到99%以上。结合病毒分离、培养、滴度测定等实验结果，最终鉴定分离得到的病毒株为猪伪狂犬病毒HN-LD株。该病毒株在临床病例中具有较高的致病性和致死率，已成为我国猪伪狂犬病防控的重点关注对象。

四、猪伪狂犬病毒HN-LD株部分毒力基因的遗传进化分析

(1)本研究选取了猪伪狂犬病毒HN-LD株的三个毒力基因：G基因、E2基因和N基因，进行遗传进化分析。通过PCR扩增，分别获得了这些基因的编码区序列。对扩增产物进行测序，获得了长度分别为1,