用RT—PCR检测犬外周血液单核细胞中犬瘟热病毒核衣壳蛋….docxVIP

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用RT—PCR检测犬外周血液单核细胞中犬瘟热病毒核衣壳蛋…

一、实验材料与方法

(1)实验材料：本研究选取了20只健康犬作为实验动物，所有犬只均来源于我国某宠物医院。血液样本采集前，所有犬只经过犬瘟热病毒抗体检测，确保实验动物无犬瘟热病毒感染。实验中使用的RT-PCR试剂盒购自某生物科技公司，试剂盒包含DNA/RNA提取试剂盒、RT-PCR反应试剂盒、DNA/RNA模板稀释试剂盒等。实验过程中使用的PCR仪器为某品牌PCR仪，电泳仪和凝胶成像系统由另一品牌提供。此外，实验所需试剂包括dNTPs、引物、缓冲液、Taq酶等，均为高纯度试剂。

(2)实验方法：首先，对采集的犬外周血进行抗凝处理，按照说明书进行血液单核细胞的分离。分离后的单核细胞用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤两次，去除多余杂质。随后，采用DNA/RNA提取试剂盒提取单核细胞中的总RNA，并使用DNaseI处理去除潜在的DNA污染。提取的RNA通过紫外分光光度计检测其浓度和质量，并按照DNA/RNA模板稀释试剂盒的说明进行稀释。设计针对犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因的特异性引物，引物序列经过BLAST分析验证其特异性。RT-PCR反应体系按照RT-PCR反应试剂盒的推荐进行配置，包括cDNA模板、引物、dNTPs、缓冲液、Taq酶等。PCR反应条件为：95℃预变性5分钟，然后进行35个循环，每个循环包括95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒。最后，将PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶成像系统观察并记录电泳结果。

(3)数据分析：实验结果采用统计学方法进行分析，包括RT-PCR产物电泳图的分析、DNA浓度测定以及定量PCR数据分析。通过凝胶成像系统对RT-PCR产物进行图像采集，使用图像分析软件对电泳条带进行定量分析，计算目的基因与内参基因的相对表达量。同时，对提取的DNA进行浓度测定，确保RT-PCR反应的模板质量。定量PCR数据采用2^-ΔΔCt方法进行统计分析，ΔΔCt值越小，表示目的基因表达水平越高。实验结果与正常犬对照组进行对比，以评估犬瘟热病毒在实验犬血液单核细胞中的感染情况。

二、实验步骤

(1)实验准备：首先，对实验犬进行编号，并详细记录每只犬的基本信息，包括年龄、性别、体重等。接着，在无菌操作条件下，采集实验犬的外周血，使用抗凝剂进行抗凝处理，以确保血液在后续实验中不会凝固。采集完毕后，立即将血液样本置于冰上保存，以防止病毒活性下降。随后，在实验室环境中，按照DNA/RNA提取试剂盒的说明书进行操作，提取血液单核细胞中的总RNA。提取过程中，使用移液器准确吸取血液样本，并按照说明书进行洗涤、重悬和沉淀步骤。在提取过程中，严格控制操作时间，避免RNA降解。提取完毕后，使用紫外分光光度计检测RNA的浓度和纯度，确保其符合实验要求。提取的RNA存储于-80℃冰箱中，待后续RT-PCR实验使用。

(2)DNA/RNA模板制备：在RT-PCR实验中，首先需要将提取的RNA进行逆转录，以合成cDNA模板。取适量的RNA溶液，按照RT-PCR试剂盒的说明进行逆转录反应。在逆转录过程中，加入逆转录酶、dNTPs、引物、缓冲液等试剂，严格控制反应条件，包括温度、时间和反应体系。反应完成后，使用DNaseI处理逆转录产物，以去除可能存在的DNA污染。处理过程中，加入DNaseI和相应的缓冲液，在37℃下反应30分钟。处理完毕后，通过离心去除DNaseI和未反应的试剂，取上清液作为RT-PCR反应的模板。同时，对提取的DNA进行浓度测定，以确保模板质量。

(3)RT-PCR反应：将制备好的DNA/RNA模板按照RT-PCR试剂盒的推荐进行反应体系配置。取适量的模板溶液，加入引物、dNTPs、缓冲液、Taq酶等试剂，混合均匀。设置PCR反应程序，包括预变性、变性、退火和延伸等步骤。在PCR反应过程中，严格控制反应温度和时间，确保PCR反应的效率和特异性。反应完成后，将PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，观察电泳结果。通过凝胶成像系统对电泳条带进行图像采集，使用图像分析软件对目的基因和内参基因的条带进行定量分析，计算目的基因与内参基因的相对表达量。将实验结果与正常犬对照组进行对比，评估犬瘟热病毒在实验犬血液单核细胞中的感染情况。同时，对实验数据进行统计学分析，以验证实验结果的可靠性。

三、结果与分析

(1)实验结果显示，通过RT-PCR检测，20只实验犬中，有15只犬的外周血液单核细胞中检测到了犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因的特异性条带，条带大小约为250bp，与预期相符。而5只未检测到犬瘟热病毒感染的犬，其RT-PCR产物在电泳图谱上未出现特异性条带。进一步定量分析显示，这15只感染犬的RT-PCR产物浓度显著高于正常对照