蛋白质分离技术层析.ppt

二、亲和层析分离1、装柱和平衡2、上样、亲和吸附3、洗脱无效洗脱吸附效率不高有效吸附第55页，共90页，星期日，2025年，2月5日洗脱方法（1）非特异性洗脱：改变洗脱液pH值离子强度梯度洗脱（2）特殊洗脱：当蛋白吸附紧密或上述方法洗脱会引起失活，可用专一的化学方法裂解配基与载体的连接键，再用透析或凝胶层析法去除配基。断键方法：硫酯键、偶氮键、二硫键（3）专一性洗脱第56页，共90页，星期日，2025年，2月5日已使用过和柱，经过再生处理，去除非特异吸附的杂质后，可重复使用。再生步骤：起始缓冲液重复平衡一次用高离子强度和低离子强度溶液处用弱酸或弱碱溶液处理4、亲和柱的再生：第57页，共90页，星期日，2025年，2月5日三、特点

1、只需一步纯化步骤2、产物非常纯3、可从很稀的溶液中纯化到所需物质4、还可去除已变性或部分降解物质第58页，共90页，星期日，2025年，2月5日四、应用1、分离和纯化2、分辨化学或遗传学上修饰的酶3、纯化亲和标记的活化中心肽段和蛋白质结构研究4、纯化人工合成的多肽和蛋白质5、解释酶作用机理第59页，共90页，星期日，2025年，2月5日实验

分离豌豆凝集素载体SephdaxG50配基葡聚糖洗脱液1mol/LNaCl特异性洗脱液1mol/LNaCl0.2mol/L葡萄糖第60页，共90页，星期日，2025年，2月5日1mol/LNaCl杂蛋白1mol/LNaCl0.2mol/L葡萄糖豌豆凝集素活性检测与兔红细胞发生凝集反应第61页，共90页，星期日，2025年，2月5日离子交换层析

ionexchangechromatography第62页，共90页，星期日，2025年，2月5日一、原理离子交换层析是用离子交换剂（具有离子交换性能的物质）作固定相，利用它与流动相中的某种离子进行可逆的交换性质来分离子型混合物的层析方法。第63页，共90页，星期日，2025年，2月5日低盐高盐分离结束第64页，共90页，星期日，2025年，2月5日带电荷不同蛋白在特定pH值下有不同带电性质第65页，共90页，星期日，2025年，2月5日离子交换树脂如何分离蛋白质洗脱树脂与树脂结合力第66页，共90页，星期日，2025年，2月5日Ve-VoKd=————Vi6、分配系数（Kd）：特点：（1）与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小有关（2）与柱的长短粗细无关每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个特定的分配系数（Kd）Ve=Vo+KdVi第23页，共90页，星期日，2025年，2月5日(2)Ve=Vo+ViKd=1分子完全不被排阻完全向凝胶颗粒内部扩散在两相分配的比值为1,最后流出.(1)Ve=VoKd=0分子完全被排阻于凝胶颗粒之外全部分布于流动相里,最先流出。(3)0Kd1Ve=Vo+ViKd为溶质以某种程度向凝胶颗粒内扩散Kd=00＜Kd1Kd=1洗脱体积第24页，共90页，星期日，2025年，2月5日?三.凝胶层析的优点1.凝胶是一种不带电荷的惰性载体，结构稳定。2.操作条件较温和。3.样品得率高,重复性好,可进行大量样品的分离纯化。四、凝胶层析的缺点1.要求样品和洗脱液的粘度很低。2.凝胶颗粒网络孔径大小非常有限,所以可被纯化的物质的分子量范围受到限制。3.凝胶结构对某些溶质分子具有吸附作用。第25页，共90页，星期日，2025年，2月5日五、凝胶的结构

与性能1.葡聚糖凝胶1959年Porath和Flodin合成（商品名为Sephadex）（1）结构：基本骨架：葡聚糖（dextran）交联剂：3-氯代-1,2-环氧氯丙烷使葡聚糖之间通过醚键交联聚合而成的三维空间网状结构。第26页，共90页，星期日，2025年，2月5日（2）特点：交联度：交联剂越多交联度越大网孔结构越紧密交联剂越少交联度越小网孔结构越疏松化学性质：稳定,不溶于水、盐、弱酸、碱和一般有