猫重组变应原Fel d 1 与乙肝病毒核心抗原融合基因的原核表达.docxVIP

PAGE

1-

猫重组变应原Feld1与乙肝病毒核心抗原融合基因的原核表达

一、实验目的

(1)本研究旨在通过构建猫重组变应原Feld1与乙肝病毒核心抗原融合基因的原核表达系统，实现对这两种重要蛋白的高效表达。Feld1是猫常见的过敏原，其表达产物在人类过敏性疾病中扮演关键角色。而乙肝病毒核心抗原则是乙型肝炎病毒感染的重要标志，其表达产物在疫苗研究和诊断中具有重要意义。通过融合表达，我们期望能够获得大量纯化的融合蛋白，为后续的免疫学研究和疫苗开发提供有力支持。

(2)研究结果显示，融合基因在原核表达系统中具有良好的表达性能。通过对表达产物的质谱分析，我们确定了融合蛋白的氨基酸序列，并通过免疫印迹实验证实了其抗原性。此外，我们还通过细胞毒性实验评估了融合蛋白对细胞的毒性影响，结果显示在合理表达水平下，融合蛋白对细胞的毒性较低，为后续的免疫活性研究提供了安全的基础。

(3)为了进一步验证融合蛋白的免疫原性，我们进行了动物免疫实验。实验结果表明，融合蛋白能够诱导动物产生特异性抗体，并且抗体滴度随着免疫剂量的增加而升高。此外，我们还通过ELISA实验检测了抗体对Feld1和乙肝病毒核心抗原的交叉反应性，结果显示融合蛋白能够与两种抗原特异性结合，这为开发新型多价疫苗提供了实验依据。本研究为过敏性疾病和乙型肝炎的预防和治疗提供了新的思路和策略。

二、实验材料

(1)实验中使用的材料包括重组质粒pET28a-Feld1-HBcAg，该质粒是通过PCR技术从猫Feld1基因和乙肝病毒核心抗原基因（HBcAg）中分别扩增出目的片段，随后通过重叠延伸PCR（Oligo-ligationPCR）方法融合而成。此外，还使用了大肠杆菌DH5α和BL21（DE3）作为宿主菌株，用于重组质粒的转化和表达。实验过程中，我们还使用了各种分子生物学试剂，如限制性内切酶、DNA连接酶、T4DNA连接酶、dNTPs、PCR引物等。

(2)在蛋白质表达过程中，我们使用了化学合成的小分子诱导剂IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）来调控蛋白表达。实验中使用的IPTG浓度为0.1至1mM，根据预实验结果确定最佳诱导条件。此外，为了纯化目的蛋白，我们使用了多种色谱技术，包括亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析。这些色谱柱均采用预装填的特定基质，以保证纯化效率和蛋白的活性。

(3)实验过程中，我们还使用了各种分析仪器，如凝胶成像系统、酶标仪、荧光显微镜、质谱仪和免疫印迹仪等。凝胶成像系统用于检测PCR产物和电泳后的蛋白条带；酶标仪用于ELISA实验中的吸光度测定；荧光显微镜用于观察细胞形态和蛋白表达；质谱仪用于鉴定蛋白质的氨基酸序列；免疫印迹仪用于检测目的蛋白的表达和纯度。这些仪器的准确性和稳定性对于实验结果的可靠性至关重要。

三、实验方法

(1)实验首先通过PCR技术从猫Feld1基因和乙肝病毒核心抗原基因（HBcAg）中分别扩增出目的片段，扩增条件为95°C预变性5分钟，随后进行35个循环（94°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸2分钟），最后在72°C延伸10分钟以完成扩增。为了确保扩增片段的准确性，我们对PCR产物进行了测序分析。随后，利用T4DNA连接酶将Feld1基因和HBcAg基因通过重叠延伸PCR方法融合，并构建重组质粒pET28a-Feld1-HBcAg。通过电转化法将重组质粒转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆并进行测序验证。

(2)在蛋白表达阶段，将验证后的重组质粒转化入大肠杆菌BL21（DE3）中。通过IPTG诱导，在37°C下培养3小时以实现蛋白表达。通过SDS分析表达产物，结果显示在约55kDa处出现特异性条带，与预期融合蛋白分子量相符。随后，通过亲和层析法纯化融合蛋白，使用Ni-NTA亲和层析柱进行蛋白质的捕获和洗脱，最终获得高纯度的融合蛋白。纯化过程中，使用Bradford法测定蛋白浓度，确保蛋白纯度和产量。

(3)为验证融合蛋白的免疫原性，进行了动物免疫实验。将纯化的融合蛋白通过腹腔注射方式免疫Balb/c小鼠，分组分别为低、中、高剂量组，每组10只小鼠。免疫周期为每周两次，连续免疫6周。免疫结束后，通过ELISA检测小鼠血清中的抗体滴度，结果显示抗体滴度随免疫剂量增加而升高。同时，通过Westernblot检测小鼠血清中的抗体与融合蛋白的结合能力，证实了融合蛋白的免疫原性。此外，还进行了细胞毒性实验，以评估融合蛋白对细胞的潜在毒性，结果显示在合理表达水平下，融合蛋白对细胞的毒性较低。

四、实验结果与分析

(1)实验结果显示，重组质粒pET28a-Feld1-HBcAg在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达出预期分子量的融合蛋白。通过SDS分析，观察到在约55kDa处有明显的蛋白条带，与理论计