蛋白质免疫印迹技术.ppt

福氏佐剂（Freund?adjuvant）,通常是由羊毛脂1份、石腊油5份。这是不完全福氏佐剂。在每毫升不完全佐剂加入1～20mg卡介苗就成为完全佐剂。第29页，共63页，星期日，2025年，2月5日（六）免疫方法抗原剂量，首次剂量为10～50μg，加强免疫的剂量约为首次剂量的1/4。首次免疫时抗原与完全佐剂等体积混合。加强免疫时用不完全佐剂。每2～3周加强免疫一次。在第2次加强免疫后2周，从耳缘静脉取2～3mL血，制备血清，检测抗体效价。如未达到预期效价，需再进行加强免疫，直到满意时为止。当抗体效价达到预期水平时，即可放血制备抗血清。第30页，共63页，星期日，2025年，2月5日抗体的产生顺序与丰度第31页，共63页，星期日，2025年，2月5日（七）抗血清的采集与保存取兔血有两种方法，一是耳缘静脉或耳动脉放血，一是颈动脉放血，也可心脏采血。小鼠取血。收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4℃下，过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，4000rpm,10min。在无菌条件，吸出血清，分装（0.05～0.2mL），贮于-80℃以下冰箱，或冻干后贮存于4℃冰箱保存。

第32页，共63页，星期日，2025年，2月5日（八）抗血清质量的评价在免疫期间，不仅各个不同的动物，而且同一动物在不同的时间内抗血清效价、特异性、亲合力等都可能发生变化，因而必须经常地采血测试。只有在对抗血清的效价、特异性、亲合力等方面作彻底的评价后，才可使用所取得的抗血清。第33页，共63页，星期日，2025年，2月5日效价?抗血清的效价，就是指血清中所含抗体的浓度或含量。效价测定的方法常用的是单向扩散免疫法，此法对所有的抗体均适用。某些由大分子（如蛋白类）抗原所产生的抗体，可用双扩散等方法测定。第34页，共63页，星期日，2025年，2月5日单向扩射免疫法：?以不同稀释度的抗血清与优质标记抗原混合，孵育24h后，测定其结合率。通常以结合率为50%的血清稀度和为效价。如某抗血清的结合率为50%时的稀释度为1：15000,则该血清的效价就是1：15000制备含有一定浓度抗血清的琼脂凝胶板（抗体固定不变）。打孔，加入不同稀释度的抗原量，进行免疫扩散。抗原与相应抗体在浓度合适时，则形成清晰的沉淀环，其直径大小与所加抗原量成正比。将已知参考抗原形成的沉淀环绘成曲线，然后以待测标本的沉淀环直径查标准曲线，计算出待测抗原的含量。第35页，共63页，星期日，2025年，2月5日第36页，共63页，星期日，2025年，2月5日双向扩散法：利用大分子抗原和抗体在琼脂平板上扩散，两者在相交处产生沉淀线，以观察和判断抗血清中是否有抗体及其浓度。双向免疫扩散第37页，共63页，星期日，2025年，2月5日免疫扩散试验1－抗原；2－7为不同稀释倍数的抗体第38页，共63页，星期日，2025年，2月5日分子杂交原理及流程图样品制备电泳杂交转膜结果显示探针制备第二部分Western－blotting检测抗血清第39页，共63页，星期日，2025年，2月5日WesternBlot原理将通过PAGE分离的蛋白质转移到NC膜或PVDF膜上；然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应；洗涤去除没有结合的特异性抗体后；加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体；加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现。第40页，共63页，星期日，2025年，2月5日第41页，共63页，星期日，2025年，2月5日免疫印迹的实验包括五个步骤：⑴固定：蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）并从胶上转移到硝酸纤维素膜上。⑵封闭：保持膜上没有抗体的结合场所，使场所处于饱和状态，用以避免特殊性抗体单独结合到膜上。第42页，共63页，星期日，2025年，2月5日⑶一抗杂交：初级抗体（第一抗体）是特异性的。⑷二抗杂交：第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性结合并作为指示物。⑸底物显色：被适当保温后的酶标记蛋白质区带，产生可见的、不溶解状态的颜色反应。第43页，共63页，星期日，2025年，2月5日三、实验仪器动物的常规免疫Western－blotting检测抗血清第44页，共63页，星期日，2025年，2月5日动物的常规免疫注射器蜗旋混合器第45页，共63页，星期日，2025年，2月5日四、操作步骤动物的常规免疫Western－blotting检测抗血清第46页，共6