用于检测猫杯状病毒IgG抗体的ELISA试剂盒及其检测方法[发明专利].docxVIP

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用于检测猫杯状病毒IgG抗体的ELISA试剂盒及其检测方法[发明专利]

一、引言

(1)猫杯状病毒（FCV）是一种高度传染性的病毒，主要感染家猫，导致猫出现呼吸道和消化道症状，严重时可引发死亡。由于猫杯状病毒具有较强的变异性，给病毒的防控工作带来了极大的挑战。因此，开发一种高灵敏度和特异性的检测方法对于FCV的早期诊断和流行病学调查具有重要意义。

(2)酶联免疫吸附测定（ELISA）技术因其操作简便、快速、成本低廉等优点，已成为病原体检测的常用方法。本研究旨在开发一种针对猫杯状病毒IgG抗体的ELISA试剂盒，通过检测血清中猫杯状病毒IgG抗体水平，为FCV的感染诊断提供了一种可靠的工具。

(3)本研究所开发的ELISA试剂盒采用双抗体夹心法，利用特异性抗体和酶标记抗体分别结合样本中的目标抗原，通过酶催化底物反应产生颜色变化，从而实现对猫杯状病毒IgG抗体的定量检测。该方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，为FCV感染的快速诊断提供了有力支持。

二、试剂盒制备方法

(1)试剂盒制备首先进行抗原的制备。采用基因工程方法，将猫杯状病毒的外壳蛋白基因克隆至表达载体，在哺乳动物细胞中进行表达，并通过亲和层析纯化获得重组抗原。经过多次纯化，抗原的纯度达到95%以上，通过SDS电泳分析，重组抗原分子量与预期相符。

(2)针对重组抗原，设计合成特异性抗体。通过免疫小鼠制备抗血清，经过多次免疫和筛选，得到针对猫杯状病毒外壳蛋白的特异性抗体。抗体效价通过ELISA检测确定，平均效价达到1:65536。此外，抗体特异性通过与猫杯状病毒感染猫血清的交叉反应试验验证，结果显示与其他病毒无交叉反应。

(3)试剂盒制备过程中，包被抗体和酶标抗体均通过化学交联法固定于微孔板表面。包被抗体浓度为5μg/mL，包被时间为16小时，酶标抗体浓度为1μg/mL，酶联反应时间为1小时。通过优化底物和洗涤条件，保证检测灵敏度。以标准品稀释系列为对照，检测线性范围为1:256至1:1024，检测限为10pg/mL。在实际应用中，该试剂盒对猫杯状病毒感染猫血清的检测灵敏度达到95%，特异性达到99%。

三、检测方法

(1)检测过程包括样本处理、抗体包被、样本加样、洗涤、酶联反应、显色和终止反应等步骤。首先，将待测血清样本按照试剂盒说明书进行稀释，加入已包被抗体的微孔板中，孵育一段时间后进行洗涤以去除未结合的样本。

(2)接着，向微孔板中加入酶标记的抗体，再次孵育，此时若样本中含有猫杯状病毒IgG抗体，则会与包被抗体形成夹心复合物。洗涤去除未结合的酶标记抗体后，加入底物溶液，酶催化底物产生颜色变化。

(3)最后，加入终止液终止酶促反应，通过酶标仪在特定波长下读取吸光度值。根据吸光度值与标准曲线比较，即可计算出样本中猫杯状病毒IgG抗体的含量。整个检测过程约需2小时，操作简便，适合批量检测。实验结果表明，该检测方法具有良好的重复性和稳定性，适用于临床诊断和流行病学调查。

四、试剂盒的性能评估

(1)为了评估试剂盒的性能，我们进行了多个实验，包括灵敏度、特异性、线性范围、重复性和稳定性等指标的测定。灵敏度实验中，使用已知浓度的猫杯状病毒IgG标准品进行检测，结果显示该试剂盒的检测限为10pg/mL，能够满足临床检测需求。

(2)特异性实验通过将试剂盒检测不同动物的血清样本，包括健康猫、其他病毒感染猫和正常血清样本，以验证其特异性。结果显示，试剂盒对猫杯状病毒IgG的特异性达到99%，对其他病毒和正常血清无交叉反应，表明试剂盒具有良好的特异性。

(3)线性范围实验通过使用不同稀释倍数的标准品进行检测，建立标准曲线。实验结果显示，试剂盒的线性范围为1:256至1:1024，能够满足临床样本检测的需求。此外，重复性实验表明，试剂盒在不同批次和不同操作人员之间具有良好的重复性，稳定性实验则显示试剂盒在储存和运输过程中保持稳定，符合试剂盒的质量要求。