蛋白质的分离和纯化.ppt

凝胶色谱柱的装填凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。第31页，共43页，星期日，2025年，2月5日关于蛋白质的分离和纯化第1页，共43页，星期日，2025年，2月5日一、蛋白质的分离2.根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。Q:下列蛋白质如何提取？酸性蛋白质；水溶性蛋白质；脂溶性蛋白质；偏碱性溶液透析液（中性缓冲液）有机溶剂原理1.根据细胞的结构特点，选择不同的破碎细胞的方法（如研磨法、超声波法、酶解法等），使各种蛋白质释放出来。第2页，共43页，星期日，2025年，2月5日一、蛋白质的分离

1.抽提方法：（1）酸性蛋白质：（2）水溶性蛋白质：（3）脂溶性蛋白质：偏碱性溶液透析液（中性缓冲液）有机溶剂第3页，共43页，星期日，2025年，2月5日二、常用的分离方法1.离心沉降法2.薄膜透析法3.凝胶色谱法4.电泳法第4页，共43页，星期日，2025年，2月5日1.离心沉降法原理：通过控制离心速率，使得分子大小、密度不同的物质发生分层沉降，从而分离出不同种类蛋白质。离心时相对分子质量大的物质先沉淀。第5页，共43页，星期日，2025年，2月5日2.薄膜透析法（1）原理：利用蛋白质分子不能透过半透膜的特性，可将蛋白质与其他小分子化合物分离开。（2）方法：将待分离的蛋白质溶液装入用半透膜制成的透析袋内，再将透析袋放入透析液中便可进行透析。半透膜能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内。第6页，共43页，星期日，2025年，2月5日小分子杂质（无机盐、单糖、二糖及氨基酸等）从透析袋中出来，而蛋白质留在袋内。第7页，共43页，星期日，2025年，2月5日3.蛋白质分离的方法：（1）透析法第8页，共43页，星期日，2025年，2月5日3.凝胶色谱法(1)凝胶：由多糖类化合物（如葡聚糖、琼脂糖）构成的多孔球体，内含许多贯穿的通道(2)原理：大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；小分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。(3)作用：使样品中分子大小不同的蛋白质按顺序分离出来第9页，共43页，星期日，2025年，2月5日下图中最早洗脱下来的是什么？为什么？第10页，共43页，星期日，2025年，2月5日第11页，共43页，星期日，2025年，2月5日第12页，共43页，星期日，2025年，2月5日用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质A．路程较长，移动速度较慢B．路程较长，移动速度较快C．路程较短，移动速度较慢D．路程较短，移动速度较快D第13页，共43页，星期日，2025年，2月5日相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个B第14页，共43页，星期日，2025年，2月5日4.电泳(1)概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。方向：向着与其所带电荷相反的电极移动。(2)泳动速度和方向：速度：带电分子的迁移速度跟各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小,形状有关。一般来说，带电颗粒所带净电荷越多，直径越小，越接近于球形，则在电场中的泳动速度越快；反之，则越慢。电泳分离时，电荷量相差越大的物质相距越远。第15页，共43页，星期日，2025年，2月5日醋酸纤维薄膜电泳琼脂糖凝胶电泳SDS—聚丙稀酰胺凝胶电泳：测定蛋白质相对分子质量。SDS能使蛋白质完全变性，SDS所带电荷大大超过了蛋白质原有电荷。迁移率取决于分子大小。(3)类型（载体）:第16页，共43页，星期日，2025年，2月5日使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A电荷的多少B分子的大小C肽链的多少D分子形状的差异第17页，共43页，星期日，2025年，2月5日下列有关蛋白质提取和分离的说法，错误的是 ()A.透析法分离蛋白质的原理是利用蛋白质不能通过半透膜的特性B.采用透