蛋白质的研究方法与原理.ppt

实际操作时：从质谱上得到的是一系列的多肽片段，每对大小相近的片段之间仅仅相差一个氨基酸残基。根据这一分子量差值的大小，较大肽段的末端残基即可准确判断。换句话说，从获得的一系列依次相差一个残基的肽段的分子质量中我们很快就可以确定最初样品多肽的末端序列（从N一末端或C一末端开始）。第63页，共121页，星期日，2025年，2月5日二、蛋白质空间结构分析（一）X射线衍射晶体分析法（二）核磁共振法（三）圆二色谱法（四）傅里叶变换红外光谱法（五）生物信息学预测蛋白质空间结构第64页，共121页，星期日，2025年，2月5日（一）X射线衍射晶体分析法第65页，共121页，星期日，2025年，2月5日X射线本质X射线是一种短波长(0.005～10nm)、高能量(2.5×105～1.2×102eV)的电磁波。它是原子内层电子在高速运动电子流冲击下，产生跃迁而发射的电磁辐射。第66页，共121页，星期日，2025年，2月5日X-射线晶体结构分析基本原理X射线衍射分析所依赖的基本原理是X射线衍射现象X射线衍射现象利用X射线的波长和晶体中原子的大小及原子间距同数量级的特性来分析晶体结构。当X射线入射到样品晶体分子上时，分子上的每个原子使X射线发生散射，这些散射波之间相互叠加形成衍射图形。衍射图形能给出样品内部结构的许多资料，如原子间的距离、键角，分子的立体结构、绝对构型、原子和分子的堆积、有序或无序的排列等。第67页，共121页，星期日，2025年，2月5日（二）核磁共振法1946年美国斯坦福大学的F.Bloch和哈佛大学的E.M.Purcell两个研究小组首次独立观察到核磁共振现象，为此他们两人获1952年诺贝尔物理奖。1983年，瑞士科学家KurtWüthrich教授实验室首次运用核磁共振方法解析了胰高血糖素（glucagon）多肽的溶液构象.发明了利用核磁共振(NMR)技术测定溶液中生物大分子三维结构的方法获得了2002年度诺贝尔化学奖第68页，共121页，星期日，2025年，2月5日NMR基本原理核磁共振(NuclearMagneticResonance)，就是处于某个静磁场中的自旋核系统受到相应频率的射频磁场作用时,共振吸收某一特定频率的射频辐射的物理过程。核磁共振波谱是测量原子核对射频辐射(约4?600MHz)的吸收，这种吸收只有在高磁场中才能产生。核磁共振波谱仪第69页，共121页，星期日，2025年，2月5日核磁共振法中几个常用的参数化学位移耦合常数NOE（核欧沃豪斯效应）信号强度谱峰面积弛豫时间第70页，共121页，星期日，2025年，2月5日（1）化学位移δ值越大，表示屏蔽作用越小，吸收峰出现在低场；δ值越小，表示屏蔽作用越大，吸收峰出现在高场。第71页，共121页，星期日，2025年，2月5日（2）耦合常数核与核之间以价电子为媒介相互耦合引起谱线分裂的现象称为自旋裂分。由于自旋裂分形成的多重峰中相邻两峰之间的距离被称为自旋－自旋耦合常数,用J表示。耦合常数用来表征两核之间耦合作用的大小。J耦合常数大小主要与连接两个核的化学键数目有关，与影响标量耦合核之间电子云分布的因素有关。第72页，共121页，星期日，2025年，2月5日（3）NOE信号强度当分子内有两个空间距离小于0.5nm的原子核时，如果用双共振法照射其中一个核，使干扰场的强度增加到刚使被干扰的谱线达到饱和，则另一个靠近的原子核的共振信号就会增加，这种现象称核欧沃豪斯效应（NOE）。第73页，共121页，星期日，2025年，2月5日（4）谱峰面积谱峰面积和分子中同一化学环境的原子核数目的多少成正比，因此峰面积的积分值可用来做定量分析的基础。第74页，共121页，星期日，2025年，2月5日（5）弛豫时间原子核从激化的状态回复到平衡排列状态的过程叫弛豫过程。它所需的时间叫弛豫时间。自旋晶格弛豫：处于高能态的氢核，把能量转给周围的分子，回到低能态。自旋-自旋弛豫：两个进动频率相同，进动取向不同的磁性核，在一定距离内时，它们相互交换能量，改变进动方向。第75页，共121页，星期日，2025年，2月5日二维核磁共振(2DNMR）NMR可获得分子内各核的化学环境、核间的耦合关系、空间构象等信息，但是当分子较大的时候，由于裂分谱线间的重叠，因此在测定了同一种核的一维谱之后，需要了解两种或三种不同核之间的联系关系，如C-H，N-H等就需要用到2DNMR，它是2个频率变量的函数，吸收峰对2个频率变量作图。1