蛋白质合成分离.ppt

第87页，共128页，星期日，2025年，2月5日2.蛋白质抽提根据要制备的蛋白质的性质，选择合适的溶剂将蛋白质与其它组分分开。合适溶剂是指选择有适宜的pH、离子强度、组成成分等的缓冲液。例如磷酸盐缓冲液柠檬酸缓冲溶液等。抽提过程中是在低温下进行的，要注意将温度控制在4～10℃；提取时需要强化传质，往往使用搅拌器，但是要注意避免剧烈搅拌或使用过大的剪切力，以防止蛋白变性。第88页，共128页，星期日，2025年，2月5日3.获得蛋白粗品即从抽提液中获得初步分离蛋白质，常用的方法有：⑴等电点沉淀法；调节提取液pH，达到目标蛋白的等电点。⑵盐析法；盐析分离的蛋白仍保持天然性质并能再度溶解。一般使用中性盐，例如最常用硫酸铵。但硫酸钠、磷酸钾效果最好。第89页，共128页，星期日，2025年，2月5日⑶有机溶剂沉淀法使用与水可任意互溶的小分子有机溶剂，例如乙醇和丙酮它们从蛋白质分子表面大量夺取水分子，迫使蛋白质通过相反电荷间的吸引力聚集，溶解性降低，进而沉淀下来。调节溶液pH，使其到达蛋白质的等电点附近时再加入有机溶剂，则沉淀效果更好。有机溶剂破坏蛋白质表面的水膜时要放热，可能导致蛋白质变性，应尽量在低温下操作并选择合适的有机溶剂浓度。第90页，共128页，星期日，2025年，2月5日常用的电泳方法除了凝胶电泳以外，还有区带电泳：支持介质为薄膜、纸等；等电聚焦电泳（IEF）：以两性电解质为电泳介质，将其制备成pH梯度，分离蛋白质等带电离子的方法。两性电解质是由多种氨基与羧基比例不同的多氨基多羧酸的混合物构成，例如丙稀酸、顺丁烯二酸、反丁烯二酸、亚甲基丁二酸等；常用的脂肪胺有乙二胺、二乙烯三胺、乙醇胺等。将上述的酸与胺进行加成反应获得。第55页，共128页，星期日，2025年，2月5日当被分离的蛋白质到达其等电点区间时，以兼性离子存在，静电荷为零，既不向正极、也不向负极泳动；等电聚焦电泳分辨率高、可大规模使用，用于分析和工业制备。现在已经有规模化生产的两性电解质销售。第56页，共128页，星期日，2025年，2月5日第三节蛋白质的盐溶与盐析盐溶：中性盐对球状蛋白质的溶解度有显著影响，在低浓度时，可以增加蛋白质的溶解度，称盐溶。盐溶是蛋白质吸附盐离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质与水之间的作用加强，溶解度增高。第57页，共128页，星期日，2025年，2月5日第58页，共128页，星期日，2025年，2月5日盐析：指蛋白质在高浓度中性盐存在时从溶液中沉淀析出的现象盐析时，同浓度二价中性盐对蛋白质溶解度的影响，要比单价大。中性盐影响蛋白质溶解度的能力是其离子强度的函数。离子强度定义为：I=1/2∑CiZi2Ci为离子的浓度，Zi为离子的净电荷第59页，共128页，星期日，2025年，2月5日计算溶液的离子强度，可将各种离子的浓度分别乘以各种离子所带的净电荷的平方，然后将所有乘积相加并除以2。例如，2mol/L硫酸铵溶液的离子强度为：［（4×1）+（2×2）］/2=6第60页，共128页，星期日，2025年，2月5日在盐析时，要加入的硫酸铵可用下式表示：⑴0℃，硫酸铵浓度由饱和度S1增至S2，应向1升溶液中添加的固体硫酸铵克数：W=505（S2-S1）/（1-0.285S2）S1和S2分别表示起始和终了饱和度.饱和度是在给定条件下某中性盐达到的最大百分浓度；505是0℃时1000mL饱和硫酸铵(100%或1.00饱和度)溶液中所含的硫酸铵克数(505g/1000毫升溶液);⑵将100mL硫酸铵溶液,由饱和度S1变为S2,应向其中加入饱和硫酸铵的毫升数V:V=100(S2-S1)/(1-S2)第61页，共128页，星期日，2025年，2月5日第四节蛋白质的性质一、蛋白质的可解离基团蛋白质分子中可解离基团的pKa值第62页，共128页，星期日，2025年，2月5日二、蛋白质的胶体性质蛋白质分子达到胶体质点的范围，具有胶体所有的性质，特别是不能通过半透膜。半透膜：能让水和小分子物质自由通过的膜。蛋白质分子表面分布大量亲水侧链，水溶液中蛋白质分子表面形成一层水膜，吸水量为0.3～0.5克/克蛋白。许多可解离的基团，与周围相反电荷的离子形成盐键,即双电层。第63页，共128页，星期日，2025年，2月5日第64页，共128页，星期日，2025年，2月5日三、蛋白质的两性性质和等电点蛋白质分子中的可解离侧链基团，有的与酸作用，有的与碱作用，是两性电解质。等电点：某一pH值时，蛋白质所带正电荷和负电荷相等，即净电荷为零，此时溶液pH值称该蛋白质的等电点。第65页，共128页，星期日，202