基因工程的基本操作程序课件.ppt

基因工程的基本操作程序基因工程技术广泛应用于现代生物学研究，为解决人类面临的重大问题提供了有效手段。

什么是基因工程？重组DNA技术基因工程的核心是重组DNA技术，将不同来源的基因片段拼接在一起，形成新的基因组合。遗传物质操作基因工程涉及对生物体遗传物质（DNA）进行人工操作，包括切割、拼接、转入和表达等。

基因工程的主要应用领域医疗领域基因工程在医疗领域有着广泛的应用，包括治疗遗传疾病、开发新型药物和疫苗、诊断疾病等。农业领域基因工程可以提高作物的产量、品质和抗病虫害能力，改善畜牧业生产效率。工业领域基因工程可以用于生产工业用酶、生物燃料、生物塑料等，推动工业发展。环境保护领域基因工程可以用于生物修复、环境监测、污染治理等，改善环境质量。

基因工程的基本操作步骤基因的获取提取目标基因，或利用PCR技术进行扩增。载体的构建将目标基因插入到合适的载体DNA中，构建重组DNA分子。重组DNA的导入将重组DNA分子导入受体细胞，例如细菌或植物细胞。转化体的筛选筛选含有重组DNA分子的细胞，并进行扩增和表达。

遗传物质的提取1细胞破碎利用物理或化学方法打破细胞膜，释放出细胞内的遗传物质。2DNA分离通过离心、沉淀等方法将DNA与其他细胞成分分离。3DNA纯化去除蛋白质、多糖等杂质，获得纯净的DNA。

遗传物质的切割1识别特定序列识别并切割特定DNA序列2切割位点在识别位点切割DNA链3产生片段产生特定长度的DNA片段

载体DNA的制备1质粒最常用的载体类型，易于提取和操作2病毒载体可将外源基因导入细胞，用于基因治疗3噬菌体载体可用于构建基因库，便于筛选和克隆

重组DNA的构建1目的基因从供体生物中分离出所需的基因2载体DNA选择合适的载体，如质粒3连接利用限制性内切酶和DNA连接酶将目的基因与载体连接

重组DNA的转化制备感受态细胞将细菌细胞处理成能够吸收外源DNA的状态。重组DNA导入将重组DNA与感受态细胞混合，并使其进入细胞内。转化细胞筛选通过抗生素或其他方法筛选出含有重组DNA的转化细胞。

重组菌株的筛选1选择性培养基使用含有特定抗生素的培养基，仅允许带有抗性基因的重组菌株生长。2基因探针利用与目的基因序列互补的探针，通过杂交方法检测重组菌株。3酶活性检测根据目的基因表达的酶活性，通过相应的生化实验进行筛选。

重组基因的表达1转录将DNA信息转录为mRNA2翻译将mRNA信息翻译为蛋白质3蛋白质折叠蛋白质形成特定的三维结构

DNA转化的原理受体细胞DNA转化是指将外源DNA导入受体细胞的过程，使受体细胞获得新的遗传特性。转化效率转化效率取决于多种因素，包括受体细胞的类型、转化方法、DNA的质量和浓度等。遗传转化成功的DNA转化导致外源DNA整合到受体细胞的基因组中，从而改变受体细胞的遗传性状。

DNA转化的几种方法热休克法将感受态细胞与重组DNA混合，在低温下进行处理，然后进行短暂的高温热休克处理，使DNA进入细胞。电穿孔法利用电脉冲在细胞膜上形成瞬时孔隙，使DNA进入细胞。病毒介导法利用病毒载体将重组DNA导入宿主细胞。

限制性内切酶的作用切割DNA限制性内切酶可以识别并切割特定的DNA序列。它们就像一把分子剪刀，能够精确地切断DNA链。构建重组DNA通过切割DNA，限制性内切酶使基因工程中构建重组DNA成为可能。它们帮助将外源基因插入载体DNA。遗传分析限制性内切酶在遗传分析中起着关键作用，例如DNA指纹图谱和基因诊断。

限制性内切酶的种类Ⅰ型识别位点和切割位点不一致，需要ATP和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作为辅助因子。Ⅱ型识别位点和切割位点一致，不需ATP和SAM，多数用于基因工程。Ⅲ型识别位点和切割位点不一致，需要ATP作为辅助因子。

连接酶的作用连接断裂的DNA链连接酶能够将断裂的DNA链重新连接起来，形成完整的双链DNA分子。构建重组DNA分子在基因工程中，连接酶可以将外源基因片段连接到载体DNA上，构建重组DNA分子。

质粒作为载体DNA的特点独立复制质粒能够在宿主细胞中独立于染色体DNA进行复制，保证了外源基因的稳定遗传。大小适宜质粒的大小通常在1-10kb之间，便于操作和构建重组DNA分子。易于分离纯化质粒可以通过各种方法从宿主细胞中分离和纯化，便于后续实验操作。有多个限制酶切位点质粒载体通常包含多个限制性内切酶切位点，方便外源基因的插入。

质粒载体的结构和功能复制起点确保质粒在宿主细胞中复制抗性基因提供对特定抗生素的抗性，便于筛选多克隆位点用于插入外源基因，方便构建重组载体

菌株培养与筛选的方法1培养基选择根据菌株的营养需求选择合适的培养基2培养条件控制温度、pH、氧气等条件的控制3筛选方法抗生素抗性筛选、颜色反应筛选、酶活性筛选等

PCR扩增技术的原理1模板DNAPCR反应需要一个模板DNA片段作