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猪繁殖与呼吸综合症病毒受体CD163敲除猪及培育方法

一、1.猪繁殖与呼吸综合症病毒背景介绍

(1)猪繁殖与呼吸综合症病毒（PorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus，PRRSV）是一种高度传染性的病毒，主要感染猪，可导致严重的繁殖障碍和呼吸系统疾病。该病毒自1987年在美国首次被发现以来，迅速传播至全球多个国家和地区，对养猪业造成了巨大的经济损失。据统计，PRRSV感染可导致猪只死亡率上升20%，生长速度减缓，饲料转化率降低，进而使得每头猪的损失可达50美元以上。

(2)PRRSV属于冠状病毒科，其基因组全长约15.2kb，编码至少10种蛋白质。病毒主要通过呼吸道和消化道传播，感染后猪只会出现发热、咳嗽、呼吸困难等症状，严重时可能导致死亡。此外，PRRSV还可引起繁殖障碍，如流产、死胎、弱仔等。近年来，研究表明PRRSV感染与猪只免疫系统功能紊乱密切相关，病毒可诱导猪只产生大量的免疫抑制细胞，从而降低猪只对其他病原体的抵抗力。

(3)针对PRRSV的防控，目前主要采取疫苗接种、药物预防和生物安全措施等综合策略。然而，由于PRRSV变异速度快，疫苗保护效果有限，加之病毒潜伏期长，给防控工作带来了很大挑战。因此，深入研究PRRSV的感染机制、病毒与宿主细胞相互作用等方面，对于开发新型防控策略具有重要意义。近年来，随着分子生物学和基因编辑技术的发展，利用基因编辑技术敲除猪体内的病毒受体，以降低猪只对PRRSV的易感性，已成为研究热点之一。

二、2.CD163在猪繁殖与呼吸综合症病毒感染中的作用

(1)CD163，也称为清道夫受体B，是一种跨膜蛋白，主要表达在单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞等免疫细胞表面。研究表明，CD163在猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）感染中扮演着重要角色。多项实验表明，PRRSV感染后，病毒可通过与宿主细胞表面的CD163结合，进入细胞内部，进而完成复制过程。例如，一项针对PRRSV感染猪巨噬细胞的实验发现，CD163敲除的巨噬细胞对PRRSV的易感性显著降低，病毒复制受到抑制。

(2)进一步研究发现，CD163在PRRSV感染过程中，不仅作为病毒受体，还参与调节宿主免疫反应。PRRSV感染后，CD163的表达水平显著升高，提示其在病毒感染早期就参与了免疫调节。此外，CD163还可与病毒复制过程中的某些蛋白相互作用，影响病毒复制效率和病毒颗粒的释放。例如，一项研究显示，PRRSV感染后，CD163与病毒蛋白N蛋白相互作用，促进病毒颗粒的组装和释放。

(3)在临床应用中，CD163的表达水平与猪只的疾病严重程度密切相关。研究表明，PRRSV感染后，CD163高表达的猪只往往表现出更严重的临床症状和更高的死亡率。此外，CD163还与猪只的免疫抑制状态有关，感染PRRSV的猪只体内CD163表达水平升高，可能导致免疫抑制，使得猪只对其他病原体的抵抗力下降。因此，针对CD163的研究有助于深入理解PRRSV的感染机制，并为开发新型治疗策略提供理论依据。

三、3.CD163敲除猪的培育方法

(1)CD163敲除猪的培育方法主要基于基因编辑技术，其中CRISPR/Cas9系统因其高效、便捷的特点，成为近年来研究的热点。在CD163敲除猪的培育过程中，首先需要对猪的基因组进行定位，确定CD163基因的具体位置。通常，研究人员会通过生物信息学分析，结合已有的基因数据库，找到CD163基因的启动子和内含子序列。

接下来，利用CRISPR/Cas9系统构建靶向CD163基因的sgRNA（单链引导RNA），并将其与Cas9蛋白一起转染到猪的胚胎干细胞中。经过筛选和培养，能够成功敲除CD163基因的胚胎干细胞会被用于胚胎移植。据报道，使用CRISPR/Cas9技术敲除猪细胞中的CD163基因，成功率可达到90%以上。

(2)在胚胎移植前，需要将经过基因编辑的胚胎进行检测，确保CD163基因的敲除效果。这一过程通常涉及PCR扩增、Sanger测序或高通量测序技术。例如，一项研究发现，通过Sanger测序，对CRISPR/Cas9敲除CD163基因的猪胚胎进行检测，结果显示有超过90%的胚胎成功敲除了CD163基因。这些胚胎随后被移植到代孕母猪体内。

移植后的胚胎在代孕母猪体内发育，成功出生的CD163敲除猪会表现出与野生型猪不同的生理特征。例如，一项研究通过CRISPR/Cas9技术敲除猪的CD163基因，发现这些猪在PRRSV感染后表现出较低的易感性。在另一项研究中，研究人员对敲除CD163基因的猪进行了长期观察，发现这些猪的免疫系统对其他病原体的抵抗力也有所增强。

(3)值得注意的是，CD163敲除猪的培育过程中，除了CRISPR/Ca