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猪A群轮状病毒BJ株的分离与鉴定

一、引言

(1)猪A群轮状病毒（Porcinerotavirus,PRRV）是一种重要的肠道病原体，对全球养猪业造成了巨大的经济损失。据世界动物卫生组织（OIE）统计，PRRV感染导致的仔猪腹泻是导致仔猪死亡率最高的疾病之一。近年来，随着我国养猪业的快速发展，猪A群轮状病毒感染的发生率和严重程度也在逐年上升。据报道，我国每年因PRRV感染造成的经济损失高达数十亿元。因此，深入研究猪A群轮状病毒的分离与鉴定，对于控制该病毒感染、保障养猪业健康发展具有重要意义。

(2)猪A群轮状病毒属于轮状病毒科，具有高度变异性和抗原性。根据基因型差异，PRRV可分为多个基因型，其中A群、B群和C群是常见的三个基因群。其中，A群轮状病毒是仔猪腹泻的主要病原之一，其引起的腹泻症状严重，病程长，死亡率高。研究表明，猪A群轮状病毒感染不仅影响仔猪的生长发育，还可能导致母猪繁殖性能下降，对整个养猪产业链产生严重影响。因此，对猪A群轮状病毒进行有效的分离与鉴定，有助于早期诊断、快速防控，降低养殖风险。

(3)目前，猪A群轮状病毒的分离与鉴定方法主要包括病毒分离培养、分子生物学检测和免疫学检测等。其中，病毒分离培养是传统的方法，具有操作简便、结果可靠等优点，但耗时较长，不利于早期诊断。分子生物学检测方法如RT-PCR、实时荧光定量PCR等，具有灵敏度高、特异性强、检测速度快等优点，但需要专业设备和人员操作。免疫学检测方法如ELISA、免疫荧光等，操作简单，成本低廉，但易受非特异性抗体干扰。因此，本研究旨在优化猪A群轮状病毒的分离与鉴定方法，提高检测效率，为猪A群轮状病毒感染的防控提供技术支持。

二、实验材料与试剂

(1)实验材料方面，本研究选取了疑似感染猪A群轮状病毒的仔猪粪便样本作为研究对象。这些样本均来源于我国不同地区的规模化猪场，经过初步的临床症状观察，疑似为猪A群轮状病毒感染。此外，实验过程中还使用了健康仔猪的粪便作为阴性对照，以确保实验结果的准确性。

(2)实验试剂主要包括病毒分离培养所需的细胞系、生长培养基、胎牛血清、抗生素等；分子生物学检测所需的RT-PCR试剂盒、荧光定量PCR试剂盒、DNA提取试剂盒、DNA标记物、引物设计合成等；免疫学检测所需的酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒、抗体、底物、洗涤液等。所有试剂均购自国内外知名品牌，确保实验结果的可靠性。

(3)实验设备包括病毒分离培养所需的细胞培养箱、超净工作台、离心机、显微镜、生物安全柜等；分子生物学检测所需的实时荧光定量PCR仪、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统等；免疫学检测所需的酶标仪、洗板机、移液器等。所有设备均经过校准，确保实验数据的准确性。此外，实验过程中还使用了计算机、数据统计分析软件等辅助设备，以优化实验流程和提高实验效率。

三、猪A群轮状病毒BJ株的分离

(1)猪A群轮状病毒BJ株的分离实验首先将疑似感染猪A群轮状病毒的仔猪粪便样本进行10倍系列稀释，然后分别接种于MDCK细胞和Vero细胞，这两种细胞系对轮状病毒具有良好的吸附和增殖能力。接种后的细胞板置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，观察细胞病变效应（CPE）。经过72小时的观察，选取出现明显CPE的细胞板进行病毒回收。

(2)病毒回收后，将MDCK和Vero细胞分别接种于新的细胞板中，重复上述接种和观察过程，以验证病毒的存在。经过三次重复分离，成功获得稳定的猪A群轮状病毒BJ株。为了进一步确认病毒株的纯度，对分离得到的病毒进行形态学观察，结果显示病毒颗粒呈球形，直径约为70-90纳米，符合轮状病毒的特征。

(3)为验证猪A群轮状病毒BJ株的感染性，将病毒颗粒接种于仔猪肠道上皮细胞中，观察细胞病变情况。结果显示，接种病毒后的细胞出现明显的细胞圆缩、脱落等病变现象，表明猪A群轮状病毒BJ株具有感染性。随后，对分离得到的病毒进行病毒滴度测定，结果显示病毒滴度高达10^6.5TCID50/mL，说明病毒具有良好的感染能力。通过对猪A群轮状病毒BJ株的分离和鉴定，为进一步研究其致病机制、疫苗研发和防控措施提供了重要基础。

四、猪A群轮状病毒BJ株的鉴定

(1)猪A群轮状病毒BJ株的鉴定首先通过分子生物学方法进行，包括RT-PCR和基因测序。实验中，选取了猪A群轮状病毒的特异性引物，对病毒RNA进行扩增。结果显示，RT-PCR扩增产物大小约为1.2kb，与预期大小相符。随后，将扩增产物进行测序，通过比对基因序列数据库，确定了病毒为猪A群轮状病毒，其基因序列同源性达到98%以上。这一结果表明，猪A群轮状病毒BJ株与已知猪A群轮状病毒株具有高度一致性。

(2)为了进一步验证猪A群轮状病毒BJ株的抗原性，我们进行了免疫学检测，包括ELISA和免疫荧光试验。在E