细胞培养基本知识基本技术.ppt

目前常用的三维培养模型：基质覆盖培养旋转烧瓶培养微载体培养预置支架培养旋转细胞培养系统自发性细胞聚集第26页，共67页，星期日，2025年，2月5日细胞培养技术的特点及应用优点：1）研究的条件可以人为控制2）研究的样本均一3）研究内容方便观察、检测、记录4）研究的费用相对于经济缺点：体外培养的细胞不能完全等同于体内的细胞。第27页，共67页，星期日，2025年，2月5日应用病毒学：病毒鉴定，病毒抗原作用，疫苗生产……免疫学：杂交瘤-单克隆抗体……遗传学：染色体分析……肿瘤学：筛选重要的抗肿瘤药物……分化及发育：刺激使细胞群体发生改变……细胞毒实验：药效测试……临床医学及生物技术：干细胞培养定向诱导分化后移植；组织工程软骨损伤修复；试管婴儿……第28页，共67页，星期日，2025年，2月5日营养需要环境要求无毒及无污染二、培养细胞生长的条件第29页，共67页，星期日，2025年，2月5日1、细胞的营养需求（1）氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子（2）促生长因子等完全培养基的组成：基础培养基80％一95％血清5％一20％碳酸氢钠2.0g/L青、链霉素各100单位／毫升第30页，共67页，星期日，2025年，2月5日基础培养基的选择参考：(1）建立某种细胞株所用的培养基应是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。(2)其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。(3)用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。常用的培养基种类RPMI-1640（标准型）、DMEM-高糖（标准型）、DMEM-低糖（标准型）、DMEM-F12等……第31页，共67页，星期日，2025年，2月5日血清热灭活：56℃,30分钟加热已完全解冻的血清(目前少用）热灭活目的：灭活血清中的补体成分。如果不做细胞因子和免疫相关的实验，建议血清不要灭活。?热处理造成血清沉淀物增多，影响血清质量。甚至严重影响细胞生长速度，且细胞贴壁率降低。血清中的沉淀物絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心3000rpm,5分钟去除，也可不用处理显微镜下“小黑点”：经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点”，常误认为血清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长，但如果怀疑血清质量，则应立即停止使用，更换另一批号的血清第32页，共67页，星期日，2025年，2月5日血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清：胎牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。第33页，共67页，星期日，2025年，2月5日pH调整液NaHCO3溶液（碱）常用浓度为7.5%。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌或高压灭菌，分装，4℃保存HEPES（分子量238.31）溶液一种弱酸，羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞无毒性主要作用:防止培养基pH迅速变动。在开放式培养条件下，观察细胞时培养基脱离了5%CO2的环境，CO2气体迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此时可以维持pH7.0左右。一般在进行克隆化培养时要添加HEPES使用终浓度一般为10-50mmol/L常配成1M储存液：用20ml双蒸水溶解4.76克HEPES，过滤除菌或高压灭菌，分装小瓶，4℃保存。使用时可向100ml培养液中加入2mlHEPES浓缩液，终浓度为20mmol/L第34页，共67页，星期日，2025年，2月5日抗菌素的使用：在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。通常是青霉素和链霉素联合使用。最终使用浓度为每毫升100单位。第35页，共67页，星期日，2025年，2月5日制备1000mlRPMI?1640培养基RPMI?1640?干粉培养基10.4g（1包）

超纯水?400ml