细胞生物学研究方法.ppt

第52页，共95页，星期日，2025年，2月5日扫描隧道显微镜DNA双螺旋结构的建立是根据X射线衍射结果推导出来的，至今还没有直接观察DNA结构的方法，所以对其中的微细结构还不够了解。用STM观察了DNA的双螺旋结构，见到DNA分子上的大沟和小沟，并且了解DNA的结构随染色体长度而异。第53页，共95页，星期日，2025年，2月5日第二节细胞组分的分析方法离心分离技术细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法特异蛋白抗原的定位与定性细胞内特异核酸的定位与定性放射自显影技术定量细胞化学分析技术核酸分子杂交技术第54页，共95页，星期日，2025年，2月5日一、离心分离技术离心分离细胞组分是最常用的分离方法，因为不同的细胞器和分子有不同的体积和密度，可在不同离心力的作用下沉降分离。用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物。差速离心：分离密度不同的细胞组分。密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离。第55页，共95页，星期日，2025年，2月5日●差速离心(differentialcentrifugation)主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。第56页，共95页，星期日，2025年，2月5日差速离心第57页，共95页，星期日，2025年，2月5日密度梯度离心第58页，共95页，星期日，2025年，2月5日二、细胞内核酸、蛋白质、

酶、糖与脂类等的显示方法原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。第59页，共95页，星期日，2025年，2月5日DNA特异性的显示方法Feulgen反应：利用酸水解去除细胞中的RNA，仅保留DNA，并且除去DNA嘌呤脱氧核糖核酸的嘌呤，使脱氧核糖的醛基暴露，所暴露出的自由醛基与希夫试剂反应呈紫红色。第60页，共95页，星期日，2025年，2月5日第61页，共95页，星期日，2025年，2月5日多糖的显示方法PAS（过碘酸希夫氏）反应利用过碘酸的强氧化作用破坏糖分子的C-C键，使糖分子氧化产生双醛基，自由的醛基与希夫试剂作用形成紫红色产物。第62页，共95页，星期日，2025年，2月5日脂类物质的显示方法对脂类物质的染色应用的是物理的扩散原理。苏丹类染料是脂溶性染剂，它溶于酒精但更易溶于脂肪，所以当含有脂肪的标本与苏丹染料接触时，它会脱离酒精而溶于脂类结构中从而显色。第63页，共95页，星期日，2025年，2月5日细胞中各种酶的显示方法由于酶易受外界条件影响而变性失活。对酶的显示一般采取间接的方法进行，对可以与酶发生特异性结合的底物进行染色从而达到显示酶的目的。在实验的过程中需在尽量保持酶的活性。第64页，共95页，星期日，2025年，2月5日三、特异蛋白抗原的定位与定性?免疫荧光技术： 快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限?免疫电镜技术：?免疫胶体金技术应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等。第65页，共95页，星期日，2025年，2月5日细胞内对于蛋白质分子的定位技术包括免疫荧光、免疫印迹以及免疫电镜等，这些技术都是基于免疫学中抗原抗体特异性反应的原理而设计的。将抗体分子上加上不同的可供识别的标记，从而显示出某种蛋白质在细胞内的分布和定位。抗原抗原抗体特异性结合免疫荧光标记免疫酶标记第66页，共95页，星期日，2025年，2月5日免疫荧光技术第67页，共95页，星期日，2025年，2月5日第20页，共95页，星期日，2025年，2月5日相差显微镜(phasecontrastmicroscope)相差显微镜在结构上进行了特别设计，尤其是光学系统有很大的不同，可用于观察未染色的活细胞。相差显微镜是能将物体本身的相位差转换为振幅差的显微镜。在普通光镜下观察标本时，是靠颜色（波长）和亮度（振幅）的差别而看到被检物体的结构，而活细胞近于无色透明，光波通过不吸收光，振幅变化不大，故人眼感觉不到，为解决这一难题，30年代（1934—1935）荷兰物理学家Zernike设计制造出相差显微镜，并用此而获1953年诺贝尔奖。第21页，共95页，星期日，2025年，2月5日相差显微镜的光学部件及光线通路第22页，共95页，星期日，2025年，2月5日相差显微镜观察