DB41T 1516-2017 犬瘟热病毒、犬细小病毒二重TaqMan MGB实时荧光PCR检测方法.docxVIP

ICS65.020.30B41

DB41

河南省地方标准DB41/T1516—2017

犬瘟热病毒、犬细小病毒二重TaqManMGB实时荧光PCR检测方法

2017-12-06发布2018-03-06实施

河南省质量技术监督局发布

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DB41/T1516—2017

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由河南省畜牧局提出。

本标准起草单位：河南省动物疫病预防控制中心，驻马店市动物疫病预防控制中心，三门峡市动物疫病预防控制中心，鹤壁市畜产品质量监测检验中心，信阳市动物疫病预防控制中心,平顶山市动物疫病预防控制中心。

本标准主要起草人：闫若潜、班付国、王华俊、赵雪丽、谢彩华、刘梅芬、赵明军。

本标准参加起草人：杨晴、孙素芳、曹伟伟、王淑娟、郭育培、王建科、黄清、韩楠、马超锋、朱前磊，杨海波、李方方。

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DB41/T1516—2017

犬瘟热病毒、犬细小病毒二重TaqManMGB实时荧光PCR检测方法

1范围

本标准规定了犬瘟热病毒（CDV）、犬细小病毒（CPV）二重TaqManMGB实时荧光PCR（FQ-PCR）检测样品采集、处理、存放及运输，操作方法及结果判定。

本标准适用于对疑似CDV、CPV感染动物的唾液、鼻液、眼角分泌物、粪便、肠内容物、血清等待检样品和死亡动物的淋巴结、扁桃体、肺脏、脾脏、肾脏等组织样品的病毒核酸检测。

2试剂和仪器设备

2.1试剂

2.1.1拭子悬液（见附录A），组织悬液（见附录A），以上试剂-20℃保存。

2.1.2裂解液（TriZol），氯仿，1×核酸电泳缓冲液，0.01mol/L（pH7.2）的磷酸盐缓冲液（PBS）（见附录A），二乙基焦碳酸酯处理水（DEPC处理水）（见附录A），以上试剂4℃保存。

2.1.3异丙醇，75%乙醇，-20℃保存。

2.1.4消化液Ⅰ,TE缓冲液（见附录A），以上试剂常温保存；消化液Ⅱ（见附录A），阳性对照、阴性对照（见附录A），以上试剂置-20℃保存。

2.1.5酚/氯仿/异戊醇混合液(25:24:1)（见附录A），试剂4℃保存。

2.1.6TaqManFQ-PCR检测用上、下游引物及探针序列参见附录B。

2.1.7犬瘟热病毒（CDV）、犬细小病毒（CPV）二重TaqManFQ-PCR反应混合液组成、说明及使用注意事项参见附录C。

2.2仪器设备

实时荧光定量PCR仪，高速冷冻离心机（12000×g以上），生物安全柜，恒温水浴锅，2℃~8℃冰箱，-70℃冰箱，单道微量移液器（0.1μL～2.5μL，0.5μL～10μL，2μL～20μL，20μL～200μL，100μL～1000μL），组织匀浆器或研钵，真空干燥器（非必备）。

3样品采集、处理、存放及运输

3.1样品采集及处理

3.1.1疑似感染动物样品

用拭子采集疑似CDV、CPV感染动物唾液、鼻液、眼角分泌物、粪便、肠内容物悬液等样品，放入盛有1.0mL拭子悬液（见附录A）的Eppendorf管中，然后将样品悬液转入无菌Eppendorf管中，4℃条件下5000r/min离心10min，取上清转入新的无菌Eppendorf管中，编号备用。

3.1.2组织样品

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组织样品采集时应采取有明显病变的淋巴结、扁桃体、肺脏、脾脏、肾脏等组织样品。用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品0.5g左右于组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨，再加0.3mL～0.5mL组织悬液混匀，然后将组织悬液转入无菌Eppendorf管中，4℃条件下5000r/min离心10min，取上清转入新的无菌Eppendorf管中，编号备用。

3.1.3血清样品

用无菌注射器自耳静脉或前腔静脉采集血液3mL～5mL，待血清析出后直接吸取至无菌Eppendorf管中，编号备用。

3.2存放与运送

采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。样品在2℃~8℃条件下保存应不超过24h；若超过24h，应放置低于-20℃冰箱，不宜反复冻融。

4操作方法

4.1样品RNA的制备

4.1.1取1.5mL灭菌Eppendorf管，每管加入300μL裂解液，然后分别加入待测样品、阴性对照、阳性对