DB41T 1422-2017 蝴蝶兰建兰花叶病毒实时荧光RT-PCR检测方法.docxVIP

ICS65.020.01B16

DB41

河南省地方标准DB41/T1422—2017

蝴蝶兰建兰花叶病毒实时荧光RT-PCR检测方法

2017-07-07发布2017-10-07实施

河南省质量技术监督局发布

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DB41/T1422—2017

前言

本标准参照SN/T2155—2008给出的规则编写。本标准由河南省农业科学院提出并归口。

本标准起草单位：河南省农业科学院园艺研究所。

本标准主要起草人：王利民、蒋卉、董晓宇、符真珠、张和臣、王慧娟、李艳敏。本标准参加起草人：高杰、张晶、袁欣。

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DB41/T1422—2017

蝴蝶兰建兰花叶病毒实时荧光RT-PCR检测方法

1范围

本标准规定了蝴蝶兰建兰花叶病毒（Cymbidiummosaicvirus）实时荧光RT-PCR检测的术语和定义、方法原理、仪器、用具、试剂、引物和检测方法。

本标准适用于蝴蝶兰植株建兰花叶病毒实时荧光RT-PCR的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改）适用于本文件。

SN/T2155—2008建兰花叶病毒检测方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

建兰花叶病毒

建兰花叶病毒（CymbidiumMosaicVirus，CymMV），为马铃薯X病毒属（Potexvirus）病毒，该病毒的分类地位、粒体结构、理化性质、基因组结构、传播方式参见附录A和SN/T2155—2008。

4方法原理

建兰花叶病毒为ssRNA病毒，通过反转录酶和DNA聚合酶的作用将RNA反转录为cDNA，针对核酸保守序列设计引物，对cDNA进行PCR扩增，分析PCR检测结果，可明确材料中是否含有病毒的核酸成分。采用实时荧光RT-PCR方法，可实时监测每次扩增中特异性序列扩增的目的片段累积量，荧光信号随时间变化形成一条曲线。通常在10个～15个循环的荧光值设定阈值和基线，荧光产生进入指数期、线性期和最终的平台期，依次可以在PCR反应处于指数期的某一点上来监测PCR产物的量。荧光强度首次超过设定阈值时PCR所需的循环次数为Ct值，与样本细胞中表达稳定、丰度较低的基因（内参基因，如Actin、GAPDH等）的Ct值进行相对定量分析，检测目的RNA片段的相对含量。

5仪器、用具、试剂及引物

5.1仪器

实时荧光PCR仪（本检测方法适用于ABI、Bio-Rad、Roche的实时荧光PCR仪）、高速冷冻离心机、漩涡震荡仪、核酸蛋白测定仪、-20℃冰箱、-80℃超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机等。

5.2用具

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移液枪、移液枪头、离心管、PCR板、研钵等。5.3试剂

所用试剂参见附录B。

5.4引物

蝴蝶兰建兰花叶病毒的实时荧光RT-PCR特异性引物为Cymv-F：5’-TGCCAGACGGTGCTATCGTA-3’、Cymv-R：5’-AGAAAGGTGGAAGAGGTCGTTG-3’，扩增获得目的片段大小为182bp。

蝴蝶兰实时荧光RT-PCR内参引物为PeActin-F：5’-CTCTTTCACAACCACTGCGG-3’、PeActin-R：5’-TGGGCACCTAAATCTCTCAGC-3’，扩增获得目的片段大小为181bp。

6检测方法

6.1样品采集

取蝴蝶兰的心叶叶尖部位5g作为待检测样品，所取得样品及时进行检测或-60℃以下低温保存。

6.2RNA提取

6.2.1加入1.5mLTrizol至2mL离心管中备用。

6.2.2取1g～2g样品液氮速冻研磨后加入离心管中，快速混匀，漩涡震荡2min～3min。

6.2.3加入300μL三氯甲烷，漩涡震荡混匀2min～3min，4℃条件12000r/min离心15min。6.2.4缓慢吸取850μL上清到新1.5mL离心管中，加入850μL异丙醇，颠倒数次混匀，-20℃静置2h左右。

6.2.54℃条件，12000r/min离心10min；用枪头吸除上清，倒扣沥干余液1min左右。

6.2.6加入70%酒精1mL，颠倒数次后，震荡仪25℃条件750r/min震荡30min。

6.2.74℃条件，750r/mi