细胞生物学常用技术.ppt

关于细胞生物学常用技术第1页，共29页，星期日，2025年，2月5日第2页，共29页，星期日，2025年，2月5日2.应用(1)条件可检测、可摄入(2)方法放射自显影（autoradiography）蛋白质-aaDNA-TRNA-U脉冲标记第3页，共29页，星期日，2025年，2月5日A放射性物质脉冲掺入活细胞B不同时间取样切片C暗处曝光D显影、定影第4页，共29页，星期日，2025年，2月5日胰岛素合成分泌过程第5页，共29页，星期日，2025年，2月5日第6页，共29页，星期日，2025年，2月5日(二)抗体示踪技术1.抗体+荧光染料光学显微镜GFPGFP融合剪切体蛋白第7页，共29页，星期日，2025年，2月5日2.抗体+电子致密物电子显微镜胶体金抗体标记胰岛素第8页，共29页，星期日，2025年，2月5日六、细胞分子生物学技术1.聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）特异性体外DNA扩增技术利用针对目的基因所设计的一对特异寡核苷酸引物，以目的基因为模板，以dNTP为原料，在DNA聚合酶作用下进行的DNA体外合成技术。第9页，共29页，星期日，2025年，2月5日（1）反应体系：模板链DNA聚合酶dNTP引物（primer）（与模板相应序列互补）（2）反应步骤：变性94℃退火55℃延伸72℃第10页，共29页，星期日，2025年，2月5日2.RealtimePCR实时定量PCR(荧光定量PCR)通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。荧光信号指数扩增阶段PCR产物量的对数值与起始模板量呈线性关系荧光背景信号阶段平台期以反应管中荧光强度达到阈值时所需的PCR反应循环个数（Cp值），表示模板中目的片段的初始含量。第11页，共29页，星期日，2025年，2月5日3.核酸分子杂交(1)Southernblotting–DNA将凝胶分离的DNA转移到固相支持膜上,然后与存在于液相中的标记探针进行杂交,以检测特定DNA序列的技术.(2)Northernblotting–RNADNADNARNADNARNARNA特异性探针第12页，共29页，星期日，2025年，2月5日A基因组DNA的消化B琼脂糖凝胶电泳分离C转膜D杂交E放射自显影第13页，共29页，星期日，2025年，2月5日(3)原位杂交技术（insituhybridization）用核酸探针与细菌、细胞或组织切片中的核酸进行杂交，以检测特定核酸分子在细胞内原有位置的方法。FISH第14页，共29页，星期日，2025年，2月5日4.基因转移技术应用物理、化学或生物学等技术和方法将外源基因转移到受体菌或细胞内，并使其在细胞内实现转入基因的扩增或表达。外源基因细菌转化真核细胞转染基因扩增蛋白质表达载体第15页，共29页，星期日，2025年，2月5日(1)限制性核酸内切酶限制性内切酶：识别DNA分子内由4～8个碱基构成的特定序列的酶，这些酶的识别位点大多是“回文”序列。粘性末端平滑末端第16页，共29页，星期日，2025年，2月5日第17页，共29页，星期日，2025年，2月5日第18页，共29页