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猪流行性腹泻病毒N基因的RT-RAA荧光法检测引物对、试剂盒及检测方法

一、引言

(1)猪流行性腹泻（Porcineepidemicdiarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV）引起的一种高度传染性疾病，主要影响仔猪，导致严重的腹泻和脱水，甚至死亡。近年来，随着全球猪肉消费量的不断增长，PEDV的传播范围也在不断扩大，给养猪业造成了巨大的经济损失。研究表明，PEDV的N基因编码的核衣壳蛋白在病毒的生命周期中起着关键作用，因此，N基因成为PEDV诊断和分子流行病学研究的重点靶点。

(2)为了有效控制PED的传播，快速、准确的检测方法至关重要。传统的PEDV检测方法主要包括免疫学检测和分子生物学检测。然而，免疫学检测存在假阳性和假阴性的风险，而分子生物学检测虽然准确度高，但操作复杂、耗时较长。因此，开发一种快速、简便、高灵敏度的PEDV检测方法对于控制PED具有重要意义。近年来，基于实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）的检测方法因其高灵敏度、特异性和快速性而被广泛应用于PEDV的检测。

(3)实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）技术是一种基于荧光标记的PCR技术，能够在短时间内对病毒核酸进行定量检测。该方法通过检测病毒N基因的特定序列，可以实现对PEDV的快速、准确检测。研究表明，RT-qPCR检测PEDV的灵敏度和特异度均高于传统的检测方法，且检测时间缩短至数小时。此外，随着技术的不断改进，基于RT-qPCR的检测方法已经能够实现自动化、高通量检测，为PEDV的防控提供了有力支持。然而，由于RT-qPCR操作相对复杂，对实验条件和人员要求较高，因此开发一种简便、易于操作的RT-RAA荧光法检测方法具有重要意义。

二、引物对设计

(1)在设计猪流行性腹泻病毒N基因的RT-RAA荧光法检测引物对时，首先需要考虑引物对在PEDV不同基因型中的保守性。通过分析PEDV全基因组序列，我们发现N基因具有较高的保守性，因此选择N基因作为检测靶点。在引物设计过程中，我们采用了BLAST工具对N基因序列进行比对，以确保引物对在PEDV不同基因型中均具有特异性。经过筛选，我们最终确定了两个引物，分别针对N基因的保守区域，其序列分别为：上游引物5-ATGCTTCTTCTCTGCTGACG-3和下游引物5-TCTTCTCTGCTGACGCTTCT-3。

(2)为了验证引物对的特异性和灵敏度，我们进行了体外扩增实验。实验中，我们使用PEDV阳性样本和阴性样本作为模板，分别进行PCR扩增。结果显示，引物对在PEDV阳性样本中成功扩增出预期的目的条带，而在阴性样本中未检测到任何扩增产物。进一步，我们通过琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行了鉴定，结果显示扩增产物大小与预期相符。通过优化PCR反应条件，我们获得了高特异性和高灵敏度的扩增结果，其中引物对在PEDV阳性样本中的灵敏度达到10copies/μL。

(3)为了进一步验证引物对的实用性，我们将其应用于实际样品检测。实验中，我们收集了多个PEDV感染猪场和健康猪场的粪便样品，分别进行RT-RAA荧光法检测。结果显示，引物对在PEDV感染猪场的粪便样品中成功检测到病毒核酸，而在健康猪场的粪便样品中未检测到。此外，我们还对引物对进行了交叉反应实验，结果表明，引物对对其他猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等猪病病毒无交叉反应。这些结果均证实了引物对在PEDV检测中的特异性和灵敏度，为后续PEDV的快速诊断提供了有力支持。

三、试剂盒制备

(1)试剂盒的制备是确保RT-RAA荧光法检测有效性的关键步骤。首先，根据引物对序列合成特异性引物和荧光标记探针。引物和探针的合成采用高纯度合成技术，确保其纯度和特异性。合成完成后，对引物和探针进行纯化，去除未反应的原料和杂质，以减少非特异性扩增。

(2)在制备试剂盒时，将合成的引物和探针与逆转录酶、DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液等PCR反应成分混合，配制成RT-RAA反应混合物。反应混合物的配制需严格控制各成分的浓度和比例，以确保RT-RAA反应的稳定性和准确性。此外，试剂盒中还包含荧光检测试剂，用于对扩增产物进行实时荧光定量分析。

(3)试剂盒制备过程中，还需对反应体系进行优化，以确定最佳的PCR反应条件。这包括反应温度、循环次数、引物和探针浓度等参数的调整。通过优化实验，我们得到了最佳的反应条件，使得RT-RAA荧光法检测PEDV的灵敏度和特异度得到显著提高。在制备过程中，所有试剂和耗材均需经过严格的质量控制，确保试剂盒的稳定性和可靠性。最终，制备完成的试剂盒在经过性能验证和稳定性测试后，可用于临床样品的检测。

四、RT-RAA荧光法检测方法

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