【大学课件】多聚酶链式反应扩增DNA片段.pptVIP

多聚酶链式反应扩增DNA片段本课程将深入探讨PCR技术，这是一种革命性的DNA扩增方法。我们将从DNA基础知识开始，逐步了解PCR的原理、步骤和应用。

什么是DNA？遗传物质DNA是生物体内携带遗传信息的核酸分子。双螺旋结构由两条互补的核苷酸链组成，呈双螺旋形态。四种碱基腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)。

DNA结构特点双链结构两条互补的核苷酸链通过氢键连接。碱基配对A与T配对，G与C配对，保证遗传信息的准确传递。反向平行两条链的方向相反，一条5→3，另一条3→5。

DNA复制机理1解链双螺旋结构解开，形成复制叉。2引物合成RNA引物提供起始点。3新链合成DNA聚合酶沿模板链延伸新链。4校对修复确保复制的准确性。

什么是PCR？定义多聚酶链式反应，一种体外扩增DNA的方法。原理模拟DNA自然复制过程，在短时间内产生大量特定DNA片段。发明者由KaryMullis在1983年发明，获1993年诺贝尔化学奖。

PCR的基本原理变性高温使DNA双链分离。退火引物与单链DNA结合。延伸DNA聚合酶合成新链。循环重复上述步骤，指数级扩增DNA。

PCR反应的步骤1准备反应混合物包括模板DNA、引物、dNTPs、DNA聚合酶和缓冲液。2设置PCR程序包括初始变性、多个循环和最终延伸。3运行PCR仪器自动执行温度循环过程。4产物分析通过凝胶电泳等方法检测PCR产物。

PCR的三个主要阶段94°C变性高温使DNA双链分离成单链。55°C退火引物与互补序列结合。72°C延伸DNA聚合酶合成新链。

引物的设计与选择长度通常为18-25个核苷酸。GC含量约40-60%，影响退火温度。特异性避免非特异性扩增。互补性避免引物二聚体和发夹结构。

模板DNA的准备来源可以是基因组DNA、cDNA或质粒DNA。纯度要求高纯度DNA可提高PCR效率和特异性。浓度通常需要1-100ng的模板DNA。

DNA聚合酶的特点耐热性能在高温下保持活性，如Taq聚合酶。高效性每分钟可合成数千个核苷酸。准确性一些聚合酶具有校对功能，如Pfu聚合酶。

PCR缓冲液的组成Tris-HCl维持适当的pH值。KCl提供适当的离子强度。MgCl?作为DNA聚合酶的辅因子。dNTPs提供合成新DNA链的原料。

PCR反应的温度控制1初始变性94-96°C，2-5分钟。2循环变性94-96°C，30秒。3退火50-65°C，30秒，取决于引物。4延伸72°C，1分钟/kb。5最终延伸72°C，5-10分钟。

PCR仪器的类型标准PCR仪适用于常规PCR反应，可同时处理多个样品。实时荧光定量PCR仪可在反应过程中实时监测DNA扩增情况。数字PCR系统通过样品分区实现绝对定量，提高灵敏度。

PCR产物的检测方法琼脂糖凝胶电泳最常用的方法，可分离和可视化DNA片段。荧光定量PCR实时监测DNA扩增，用于定量分析。毛细管电泳高分辨率分离，适用于短片段DNA。测序直接确定PCR产物的核苷酸序列。

琼脂糖凝胶电泳制胶准备含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶。上样将PCR产物和DNA标记物加入凝胶孔中。电泳施加电场，使DNA片段按大小分离。成像在紫外光下观察DNA条带。

荧光定量PCR原理利用荧光染料或探针实时监测DNA扩增。优势高灵敏度，可实现DNA的精确定量。应用基因表达分析、病原体检测、SNP分型等。

逆转录PCR1RNA提取从样品中分离纯化RNA。2逆转录利用逆转录酶将RNA转化为cDNA。3PCR扩增使用常规PCR方法扩增cDNA。4产物分析通过凝胶电泳或测序分析PCR产物。

PCR的应用领域分子生物学研究基因克隆、突变检测、基因表达分析。医学诊断遗传病筛查、病原体检测、肿瘤标志物分析。农业和环境转基因生物检测、物种鉴定、环境监测。

基因表达分析RT-PCR检测特定基因的mRNA表达水平。qRT-PCR定量分析基因表达变化。数字PCR高精度绝对定量基因表达。多重PCR同时分析多个基因的表达。

基因诊断与鉴定遗传病筛查检测致病基因突变，如囊性纤维化。肿瘤标志物检测分析特定基因的突变或表达变化。个体识别通过STR分析进行DNA指纹鉴定。

基因测序1PCR扩增扩增目标DNA片段。2纯化去除多余引物和dNTPs。3测序反应使用测序引物和荧光标记ddNTPs。4数据分析解读测序结果，获得DNA序列信息。

病毒检测高灵敏度可检测极低浓度的病毒DNA或RNA。高特异性通过特异性引物精确识别目标病毒。快速诊断在几小时内完成检测，有利于及时治疗。定量分析通过qPCR实现病毒载量的精确测定。

法医DNA分析样本采集从犯罪现场收集生物样本。DNA提取从样本中分离纯化DNA。STR分析通过PCR扩增短串联重复序列。数据比对与DNA数据库进行比对。

细菌鉴定16SrRNA基因分析通过PCR扩增和测序