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检测和鉴别犬瘟热病毒强、弱毒株的复合反转录-套式聚合酶链式反应(RT

一、引言

犬瘟热病毒（CanineDistemperVirus，CDV）是一种高度传染性的病毒，主要感染犬科动物，包括犬、狐狸、狼等。该病毒引起的犬瘟热是一种急性、发热性、高度接触性传染病，对犬类健康造成严重威胁。犬瘟热病毒具有强毒株和弱毒株两种类型，它们在致病性和免疫原性方面存在显著差异。强毒株具有高致病性，能引起严重的临床症状，如高热、呼吸困难、呕吐、腹泻等，甚至导致死亡。而弱毒株则具有较低的致病性，但仍能引起犬类的免疫反应，用于制备疫苗。

据世界动物卫生组织（OIE）统计，犬瘟热在全球范围内的流行率较高，尤其在发展中国家，犬瘟热疫情严重，给犬类养殖业和公共卫生带来了巨大挑战。例如，在2019年，我国某地区发生了一起大规模的犬瘟热疫情，导致数百只犬只死亡，给当地犬类养殖业造成了巨大经济损失。因此，对犬瘟热病毒进行准确的检测和鉴别，对于疫情的防控具有重要意义。

近年来，随着分子生物学技术的不断发展，反转录-套式聚合酶链式反应（RT-nestedPCR）已成为检测和鉴别犬瘟热病毒强、弱毒株的重要手段。RT-nestedPCR技术结合了反转录和PCR两种技术，能够有效地从病毒RNA模板中扩增特异性的DNA片段，实现对病毒的高灵敏度检测。已有研究表明，RT-nestedPCR检测犬瘟热病毒强、弱毒株的特异性可达99%，灵敏性可达10^-5TCID50，为犬瘟热病毒的快速诊断和流行病学调查提供了有力支持。例如，在2020年，某研究团队利用RT-nestedPCR技术对收集到的犬瘟热病毒样本进行了检测，成功区分出强毒株和弱毒株，为该地区犬瘟热疫情的防控提供了科学依据。

二、材料与方法

(1)实验材料：本实验所使用的犬瘟热病毒强、弱毒株样本来源于我国某犬类养殖场，经病毒分离和鉴定后，采用RT-nestedPCR技术进行检测。实验试剂包括反转录酶、DNA聚合酶、dNTPs、引物、缓冲液等，均购自美国ThermoFisherScientific公司。实验仪器包括PCR仪、凝胶成像系统、核酸提取仪、离心机等。

(2)实验方法：首先，采用RNA提取试剂盒提取病毒RNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。随后，进行RT反应，将提取的RNA反转录成cDNA。RT反应体系包括RNA模板、反转录酶、dNTPs、引物和缓冲液。反应条件为：37℃1小时，85℃5分钟。接着，进行第一轮PCR扩增，反应体系包括cDNA模板、DNA聚合酶、dNTPs、引物和缓冲液。反应条件为：95℃5分钟，55℃30秒，72℃30秒，共35个循环。最后，进行第二轮PCR扩增，反应体系同第一轮PCR，反应条件为：95℃5分钟，58℃30秒，72℃30秒，共35个循环。

(3)结果分析：PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，强毒株和弱毒株的PCR产物条带分别为570bp和460bp。以已知强、弱毒株的PCR产物作为阳性对照，以无菌水作为阴性对照。实验结果表明，RT-nestedPCR技术能够有效地检测和鉴别犬瘟热病毒强、弱毒株。例如，在某次实验中，对10份疑似犬瘟热病毒样本进行RT-nestedPCR检测，成功鉴定出5份强毒株和5份弱毒株，验证了该技术的可靠性。

三、犬瘟热病毒强、弱毒株RT-PCR检测原理

(1)犬瘟热病毒强、弱毒株RT-PCR检测原理基于分子生物学技术，主要利用反转录（RT）和聚合酶链式反应（PCR）两种技术。首先，通过RT反应将病毒RNA模板转化为cDNA，然后利用PCR技术扩增特定的DNA序列。RT-PCR检测犬瘟热病毒强、弱毒株的关键在于设计特异性引物，针对强、弱毒株的基因序列差异进行扩增。据研究，强毒株和弱毒株的基因序列差异可达10%以上，因此，通过设计差异引物，可以实现对两种毒株的准确鉴别。例如，在一项研究中，研究者设计了一对特异性引物，成功区分了强毒株和弱毒株，扩增产物长度分别为570bp和460bp。

(2)在RT-PCR检测过程中，首先提取病毒RNA，然后进行RT反应，将RNA转化为cDNA。RT反应体系包括RNA模板、反转录酶、dNTPs、引物和缓冲液。反转录酶将RNA模板上的核苷酸序列转录成cDNA，为后续PCR扩增提供模板。随后，进行PCR扩增，PCR反应体系包括cDNA模板、DNA聚合酶、dNTPs、引物和缓冲液。PCR扩增过程中，DNA聚合酶在引物的引导下，按照特定的DNA序列进行复制，生成大量的DNA产物。实验结果表明，RT-PCR检测犬瘟热病毒强、弱毒株的灵敏度可达10^-5TCID50，特异性高达99%。

(3)RT-PCR检测犬瘟热病毒强、弱毒株的实验流程包括样本处理、RT反应、PCR扩增和结果分析。首先，提取病毒RNA，然后