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二氢杨梅素手性异构体检测液相色谱法

1范围

本标准规定了用高效液相色谱法测定(2R,3R)-二氢杨梅素和(2S,3S)-二氢杨梅素含量的试验方法。本标准适用于植物提取来源的二氢杨梅素产品中手性异构体的种类判定和含量测定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T16631高效液相色谱法通则

GB/T603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备JJG705-2014液相色谱仪检定规程

DB45/T1178-2015藤茶中二氢杨梅素的测定高效液相色谱法

3方法提要

用高效液相色谱法，在选定的工作条件下，通过手性色谱柱使样品溶液中二氢杨梅素手性异构体分离，用紫外检测器测定，外标法定量，计算样品中(2R,3R)-二氢杨梅素和(2S,3S)-二氢杨梅素的质量分数。

4试剂和材料

4.1正己烷：色谱纯。

4.2无水乙醇：色谱纯。

4.3三氟乙酸（TFA）：色谱纯。

4.4参比物质1（对照品）：(2S,3S)-二氢杨梅素对照品，化学纯度≥99%（HPLC），光学纯度（e.e.值）≥99%（HPLC），购自广州研创生物技术发展有限公司。

4.5参比物质2（对照品）：(2R,3R)-二氢杨梅素对照品，化学纯度≥99%（HPLC），光学纯度（e.e.值）≥99%（HPLC），购自广州研创生物技术发展有限公司。

4.60.1%三氟乙酸正己烷溶液（体积分数）：准确量取1mL三氟乙酸至一定体积的正己烷中，置于1000mL量瓶中，加入正己烷定容。

5仪器和设备

5.1高效液相色谱仪：配紫外检测器（UV），其灵敏度及稳定性应符合GB/T16631。

5.2色谱柱：规格为250mm×4.6mm(id)手性色谱柱，柱内填充表面涂覆三（3,5-二甲基苯氨基甲酰化）直链淀粉衍生物的5μm多孔球形硅胶填料（EnantioPak?AD柱）。

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5.3分析天平：感量0.01mg。

5.4量瓶：20mL、10mL、5mL。

5.5微量移液器：100-1000μL量程。

5.6滤膜：0.45μm有机滤膜。

6测定步骤

6.1样品溶液的制备

6.1.1混合对照品标准储备溶液的制备

分别精密称定一定量的(2S,3S)-二氢杨梅素和(2R,3R)-二氢杨梅素对照品置于同一量瓶中，加入乙醇稀释至刻度，配成2mg/mL的混合对照品标准储备溶液，冰箱4℃冷藏保存，可使用一周。

6.1.2(2S,3S)-二氢杨梅素标准储备溶液和(2R,3R)-二氢杨梅素标准储备溶液的配制

分别精密称定一定量的(2S,3S)-二氢杨梅素、(2R,3R)-二氢杨梅素对照品，置于不同量瓶中，加入乙醇稀释至刻度，分别配成约1mg/mL的(2S,3S)-二氢杨梅素标准储备溶液和(2R,3R)-二氢杨梅素标准储备溶液，冰箱4℃冷藏保存，可使用一周。

6.1.3标准工作曲线溶液的配制

精密量取混合对照品标准储备溶液（见6.1.1）一定体积，置于5mL量瓶中，加入乙醇稀释至刻度，摇匀，配制成系列标准混合工作溶液：0.005mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL和0.8mg/mL，分别编号1、2、3、4、5、6和7。

6.1.4供试品溶液的制备

取供试品10mg，精密称定，置于20mL量瓶中，加入乙醇稀释至刻度，现配现用。

6.2高效液相色谱测定

6.2.1色谱分析条件

按高效液相色谱操作规程开机预热，调节温度及流量，达到分析条件并基线平稳后进样分析。推荐的色谱柱及典型色谱操作条件见表1，其他能达到等同分离程度的色谱柱和色谱操作条件均可使用。

表1色谱柱和典型色谱操作条件

色谱柱

5μm多孔球形硅胶，表面涂敷有三（3,5-二甲苯基氨基甲酰化）直链淀粉（EnantioPak?AD柱），柱长250mm，柱内径4.6mm；

流动相

正己烷(0.1%三氟乙酸)：乙醇=80:20(v/v)，等度洗脱

柱温

25℃

流速

1mL/min

检测波长

290nm

进样量

10μL

6.2.2标准工作曲线测定

将上述系列标准混合工作溶液（见6.1.3）按色谱条件（见6.2.1）进行测定，以(2S,3S)-二氢杨梅素或(2R,3R)-二氢杨梅素峰面积为y轴，对应的(2