生物制药酶类药物.ppt

(二)酶的提取1.水溶液法常用稀盐溶液或缓冲液提取。经过预处理的原料，包括组织糜，匀浆，细胞颗粒以及丙酮粉等，都可以用水溶液抽提。许多酶再蒸馏水中不溶解，而在低盐浓度下易溶解，所以提取时加入少量盐可提高酶的溶解度。第30页，共72页，星期日，2025年，2月5日2.有机溶剂法某些结合酶如微粒体和线粒体膜的酶，由于和脂质牢固结合，用水很难提取，为此必须除去结合的脂质，且不能使酶变性，最常用的有机溶剂是丁醇。丁醇具有以下特点：（1）亲脂性强，特别是亲磷脂的能力；（2)兼具亲水性，在0℃在水中的溶解度为10.5%；（3）在脂与水分子间能起类似去垢剂的桥梁作用。3.表面活性剂法第31页，共72页，星期日，2025年，2月5日(三)酶制剂的工业提取法1.发酵液的预处理及过滤絮凝剂2.酶液的脱色0.1~1.5%活性炭3.盐析法4.有机溶剂法5.喷雾干燥直接制备粉末酶制剂第32页，共72页，星期日，2025年，2月5日酶的分离提纯三个基本环节：第一抽提，即把酶从材料转入溶剂中制成酶溶液；第二纯化，即把杂质从酶溶液中除掉或从酶溶液中把酶分离出来；第三制剂，即将酶制成各种剂型。在酶的分离纯化过程中．每步都须做三件事：第一，测定酶活力(IU/m1)；第二，测定蛋白质含量(mg/m1)；第三，测量体积(m1)。第33页，共72页，星期日，2025年，2月5日酶是生物活性物质，操作条件要温和，一般在0～5℃间进行。初分：用分离蛋白质的方法，如盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级、选择性热变性等方法可从酶粗提液中初步分离酶。细分：再采用吸附层析、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析、疏水层析及高效液相色谱法等层析技术或各种制备电泳技术进一步纯化酶，以得到纯的酶制品结晶:酶的结晶过程进行得很慢，需要数天或数星期。第34页，共72页，星期日，2025年，2月5日凡用于蛋白质的纯化手段均适用于酶的纯化酶的提纯常包括两方面的工作:(1)浓缩：把酶制剂从很大体积浓缩到比较小的体积，(2)去杂蛋白：把酶制剂中大量的杂质蛋白和其他大分子物质分离出去。(四)酶的纯化第35页，共72页，星期日，2025年，2月5日一般原则：防止强酸、强碱,要求加入的化学试剂不使酶变性；在低温下操作，全部操作在低温0～4℃；在分离提纯过程中，避免剧烈搅拌；在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量EDTA、少量β-巯基乙醇；在不破坏所需酶的条件下，可使用各种“激烈”的手段。第36页，共72页，星期日，2025年，2月5日(一)杂质的除去酶提取液中，除所需酶外，还含有大量杂蛋白，多糖，脂类和核酸等，需要除去。（1）pH和加热沉淀法利用蛋白质酸碱变性性质的差异可以通过调pH和等电点除去某些杂蛋白，也可以利用不同蛋白质对热稳定性的差异。（SOD酶）（2）蛋白质表面变性法利用蛋白质表面变性性质的差别，也可以除去杂蛋白。制备过氧化氢酶，加入氯仿除杂蛋白。第37页，共72页，星期日，2025年，2月5日(3)选择性变性法利用蛋白质稳定性的不同，除去杂蛋白。(4)核酸沉淀剂法在微生物制备酶时，常含有较多核酸，可用核酸酶降解，离心分离，用核酸沉淀剂如三甲基十六烷基溴化铵，硫酸链霉素等。(5)将酶与底物结合，用加热法除去杂蛋白。近来发现，酶和底物结合或竞争性抑制剂结合后，稳定性大大提高，这样可以用加热法除去杂蛋白。第38页，共72页，星期日，2025年，2月5日基本操作程序：分离：先进行净化处理（过滤，絮凝，离心脱色），再采用沉淀法分离（盐析法，沉淀法，超离心等）。第39页，共72页，星期日，2025年，2月5日酶分离方法有：分子大小:如离心分离法、筛膜分离法、凝胶过滤法等。溶解度大小:如盐析法、有机溶剂沉淀法、共沉淀法、选择性沉淀法、等电点沉淀法等。所带正负电荷:如离子交换分离法、电泳分离法、聚焦层析法等。稳定性差异:如选择性热变性法、表面变性法等亲和作用的差异:如亲和层析法等.第40页，共72页，星期日，2025年，2月5日纯化：采用离子交换层析，凝胶过滤，液相色谱，亲和色谱和超滤等方法。第41页，共72页，星期日，2025年，2月5日1.凝胶过滤法(分子筛)原理将样品混合物通过一定孔径的凝胶介质,由于流经路径的差异,使不同分子质量的组分分离；大分子物质直接从凝胶颗粒外通过，走得快；小分子物质进入凝胶颗粒的内部再出来，走得慢。