牛肠道疾病的一种新病原鉴定.ppt

脂溶剂敏感性试验结果将病毒经过氯仿处理后接种MDBK细胞，细胞毒TCID50=10-4.02/0.1ml。与未用氯仿处理的病毒的TCID50（10-4.05/0.1ml）相比，二者滴度相差小于一个对数，故判定未知病毒对氯仿不敏感，为无囊膜病毒。某些病毒耐酸，例如小RNA病毒科中的肠道病毒，但同科中鼻病毒和口蹄疫病毒却对酸敏感。因此耐酸性试验也是病毒鉴定上一个比较重要的项目。将病毒液等量分装于15ml离心管中。用0.1N的HCl将小瓶中的病毒液的pH调至3.0，并向另1个离心管内的病毒液加入相同于用酸量的灭菌的PBS做对照。置于37℃的恒温水浴锅或者室温感作1h，再用5.6%NaHCO3溶液将PH调回至7.2左右。此后将两瓶病毒液分别用敏感细胞测定感染力。如果试验组感染力比对照组感染力降低2个对数以上乃至完全灭活者，则证明该病毒对酸敏感。滴度相差小于1个对数者为耐酸。将病毒液经过HCl处理，再用NaCO3将pH调回至7.2后接种MDBK细胞，细胞毒TCID50=10-4.17/0.1ml。01与用等量PBS处理的对照组TCID50（10-3.77/0.1ml）相比，二者滴度相差小于一个对数，故判定未知病毒对pH3环境耐受。02胰蛋白酶敏感性试验灰质炎病毒、猪传染性胃肠炎冠状病毒等对胰蛋白酶具有较高的抵抗力。相反，某些病毒，例如痘病毒、呼肠孤病毒和疱疹病毒等却易被胰蛋白酶灭活。因此，胰蛋白酶试验也常用于一些病毒的鉴定。胰蛋白酶敏感性试验方法*于灭菌15ml离心管内，加入病毒液500μl，再加入溶于pH7.4PBS的1%胰蛋白酶溶液500μl，使胰蛋白酶终浓度为0.5%，充分混合。置37℃作用1h，随即加入灭活的犊牛血清4ml，充分混合，终止胰蛋白酶的作用。另取同样的病毒液500μl，加入pH7.4PBS液500μl，混合和37℃放置1h后，加入灭活犊牛血清4ml作为对照。最后将上述两份混合液分别在BK细胞测定感染力。感染力比对照组降低2个对数以上，以至完全丧失感染力者，判为对胰蛋白酶敏感；滴度相差小于1个对数者，判为对胰蛋白酶抵抗。将病毒经过胰蛋白酶处理后接种MDBK细胞，细胞毒TCID50=10-3.06/0.1ml。与用等量PBS处理的对照组TCID50（10-3.17/0.1ml）相比，二者滴度相差小于一个对数，故判定未知病毒对胰蛋白酶不敏感。耐热性试验1不同病毒对不同温度的敏感度以及耐受时间不同，故可以通过热敏感性试验及结合二价阳离子保护性试验（二价阳离子例如MgCl2，能够明显提高某些病毒对50-55℃高温处理的抵抗力）对病毒进行鉴定。2耐热性试验方法将病毒悬液分为等量4管，置于50℃水浴分别感作5、10、15和30min，随后测定感染力。如果试验组感染力比对照组感染力降低2个对数以上乃至完全灭活者，则证明该病毒在此时间内对50℃敏感。滴度相差小于1个对数者表明病毒在此时间内对50℃耐受。对50℃的耐受时间对不同温度的耐受将病毒悬液分为等量4管，分别置于50℃、60℃、70℃、80℃水浴1h，测定感染力。如果在某个温度下试验组感染力比对照组感染力降低2个对数以上乃至完全灭活者，则证明该病毒对此温度敏感。滴度相差小于1个对数者为耐受。二价阳离子保护性试验将MgCl2用蒸馏水配成1.1M溶液。另将病毒液分成两份，分别用1.1MMgCl2溶液和生理盐水（对照）作10×稀释，置50℃水浴感作1h后，在细胞培养物上滴定感染力，如果试验组感染力比对照组感染力提高2个对数以上，则证明MgCl2对病毒具备保护性。滴度相差小于1个对数者为不具有保护性。分别将经过50℃、60℃、70℃、80℃处理1h的病毒，接种BK细胞，3天后观察均不引起细胞病变，由此可知50℃作用1h便可灭活病毒。对不同温度的耐受1对50℃的耐受时间分别将经过50℃处理5min、15min、30min、1h的病毒，接种BK细胞，3天后观察均不引起细胞病变。由此可知，50℃作用5min便可灭活裸露状态的病毒。2二价阳离子保护性试验将MgCl2溶液处理的病毒液置于50℃水浴1h后接种MDBK细胞，细胞毒TCID50=10-5.06/0.1ml。与未使用MgCl2溶液且经过同样高温处理的病毒（完全灭活）相比较，可以判定MgCl2溶液对处于50℃高温环境中的未知病毒具有保护力。*病毒核酸型鉴定——RNA（抑制滴度小于一个对数）脂溶剂敏感试验——无囊膜（TCID50：10-4.02/0.1mlVS10-4.05/0.1ml）胰酶敏感试验——不敏感（TCID50：10-3.06/0.1mlVS10-3.17/0.1ml）耐酸性试验——pH3耐受（TCID5